Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Riepilogo

Presentiamo un metodo che utilizza un approccio di analisi delle immagini generalizzabile basato sull'area per identificare i conteggi delle cellule. L'analisi di diverse popolazioni cellulari ha sfruttato le significative differenze di altezza e struttura cellulare tra diversi tipi di cellule all'interno di un algoritmo adattivo.

Abstract

La quantificazione delle cellule è necessaria per una vasta gamma di studi biologici e biochimici. L'analisi convenzionale delle immagini delle cellule impiega in genere approcci di rilevamento della fluorescenza, come la colorazione immunofluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti o tecniche di rilevamento dei bordi, che sono spesso soggette a errori a causa del rumore e di altre non idealità nello sfondo dell'immagine.

Abbiamo progettato un nuovo algoritmo in grado di contare e distinguere con precisione macrofagi e fibroblasti, cellule di diversi fenotipi che spesso colocalizzano durante la rigenerazione dei tessuti. MATLAB è stato utilizzato per implementare l'algoritmo, che differenziava tipi di celle distinti in base alle differenze di altezza dallo sfondo. Un algoritmo primario è stato sviluppato utilizzando un metodo basato sull'area per tenere conto delle variazioni nelle dimensioni / struttura delle cellule e nelle condizioni di semina ad alta densità.

Le non idealità nelle strutture cellulari sono state spiegate con un algoritmo secondario iterativo che utilizza parametri interni come la copertura cellulare calcolata utilizzando dati sperimentali per un determinato tipo di cellula. Infine, è stata effettuata un'analisi degli ambienti di cocoltura utilizzando un algoritmo di isolamento in cui sono stati esclusi selettivamente vari tipi di cellule in base alla valutazione delle differenze di altezza relative all'interno dell'immagine. Questo approccio è stato trovato per contare accuratamente le cellule entro un margine di errore del 5% per le cellule monocolturate e all'interno di un margine di errore del 10% per le cellule cocolturate.

Introduzione

Il software viene regolarmente implementato durante le tecniche di analisi delle immagini per garantire che i risultati siano accurati, efficienti e imparziali. Per i saggi basati su cellule, un problema comune è l'errata identificazione delle cellule. Le immagini con impostazioni focali e di contrasto improprie possono portare alla sfocatura delle cellule, in cui il confine delle singole cellule diventa difficile da identificare¹. La presenza di caratteristiche dell'immagine estranee come pori, bolle o altri oggetti indesiderati può ostacolare le procedure di conteggio rallentando il processo di conteggio e portando a un'errata identificazione. Inoltre, il conteggio delle cellule può essere oneroso e il conteggio di centinaia di repliche può richiedere molto tempo. Inoltre, esiste un pregiudizio soggettivo intrinseco durante il conteggio manuale, e quindi il processo decisionale relativo all'identificazione delle cellule è spesso impreciso². Il software automatizzato offre un potenziale entusiasmante per aggirare tutti questi problemi differenziando rapidamente e con precisione le cellule da oggetti estranei, compresi gli oggetti ben oltre la capacità umana di rilevamento preciso, sulla base di criteri di identificazione ben definiti che riducono l'influenza del pregiudizio dello sperimentatore. Le tecniche comuni per identificare le cellule utilizzando software automatizzati coinvolgono due metodi principali: segmentazione e soglia³. Qui, dimostriamo un protocollo generalizzabile basato sull'area che consente un conteggio delle celle rapido, accurato ed economico all'interno di un framework software ampiamente accessibile.

Le tecniche di segmentazione, come il rilevamento dei bordi, cercano di isolare le singole cellule utilizzando le differenze di intensità all'interno di un'immagine. I cambiamenti di intensità che distinguono una cella dal resto dell'immagine consistono più spesso in cambiamenti nitidi nella luminosità⁴. Il rilevamento dei bordi comporta una fase di filtraggio regolarizzante, seguita da una fase di differenziazione in cui vengono rilevate variazioni di intensità. Il processo di differenziazione identifica bordi e contorni all'interno dell'immagine di cambiamenti ad alta intensità e questi bordi e contorni sono correlati alla presenza cellulare. Sebbene le immagini con rumore possano essere eseguite tramite algoritmi di denoising⁴, le tecniche di rilevamento dei bordi sono idealmente utilizzate per analizzare immagini con basso rumore di fondo. Il processo funziona in modo ottimale quando i confini delle cellule sono chiaramente e facilmente distinguibili e non sono ostacolati da contorni di luminosità non correlati alla presenza cellulare, alla sfocatura cellulare, agli oggetti estranei o alle strutture cellulari interne definite ^1,2. Se un'immagine è particolarmente rumorosa, le cellule possono essere ulteriormente distinte attraverso la colorazione fluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti ^2,5. Sebbene ciò migliori significativamente l'accuratezza delle tecniche di segmentazione, richiede costi aggiuntivi e ulteriori investimenti di tempo per preparare le colture cellulari per l'imaging.

Le tecniche di soglia prevedono la divisione di un'immagine in due categorie: il primo piano e lo sfondo, con celle assegnate al primo piano³. Queste tecniche utilizzano cambiamenti di colore / contrasto per definire l'altezza apparente di un oggetto; gli oggetti che sono abitualmente "più alti" dello sfondo possono essere facilmente identificati come celle. La trasformazione spartiacque funziona in questo modo associando superfici con pixel chiari come primo piano e quelle con pixel scuri come sfondo ^6,7. Attraverso l'identificazione basata sull'altezza, le tecniche di soglia possono regolarmente distinguere il rumore dagli oggetti desiderati, a condizione che esistano all'interno dello stesso piano focale. Se abbinata a una quantificazione basata sull'area, una trasformazione spartiacque può identificare con precisione gruppi di oggetti in ambienti in cui le tecniche di segmentazione tipiche come il rilevamento dei bordi sarebbero imprecise.

Le trasformazioni spartiacque sono comunemente accoppiate con tecniche di segmentazione per preparare le immagini per un'analisi più pulita, con conseguente maggiore precisione del conteggio delle cellule. Per questo processo, la trasformazione spartiacque viene utilizzata per evidenziare potenziali regioni di interesse prima della segmentazione. Una trasformazione spartiacque offre vantaggi unici identificando le cellule in primo piano delle immagini, che possono migliorare l'accuratezza dell'analisi di segmentazione rimuovendo potenziali falsi positivi per le cellule, come macchie irregolari di sfondo. Tuttavia, possono sorgere difficoltà quando si tenta di adattare le immagini basate su cellule a una trasformazione spartiacque. Le immagini con alta densità cellulare possono essere afflitte da sottosegmentazione, in cui aggregati di cellule sono identificati come un gruppo singolare piuttosto che come singoli componenti. La presenza di rumore o bruschi cambiamenti di intensità può anche causare sovrasegmentazione, in cui l'algoritmo sovraisola le cellule, con conseguente conteggio eccessivo e impreciso delle cellule⁸.

Qui, descriviamo in dettaglio un metodo per ridurre al minimo gli svantaggi primari della trasformazione spartiacque incorporando componenti di un'analisi di soglia all'interno di un algoritmo di quantificazione basato sull'area, come illustrato nella Figura 1. In particolare, questo algoritmo è stato implementato con software open source e / o ampiamente disponibile e l'applicazione di questo framework di conteggio delle cellule è stata possibile senza costosi reagenti o complesse tecniche di preparazione cellulare. I macrofagi RAW264.7 sono stati utilizzati per dimostrare il metodo a causa del loro ruolo critico nella regolazione del mantenimento del tessuto connettivo e dei processi di guarigione delle ferite⁹. Inoltre, i fibroblasti NIH / 3T3 sono stati analizzati a causa del loro ruolo chiave nella manutenzione e riparazione dei tessuti. Le cellule dei fibroblasti spesso coesistono e supportano i macrofagi, generando la necessità di distinguere questi tipi di cellule fenotipicamente distinti negli studi di cocoltura.

I conteggi cellulari da immagini con alta densità cellulare vitale (VCD) potrebbero essere quantificati in modo affidabile ed efficiente calcolando l'area coperta dalle celle e l'area media occupata da una singola cella. L'uso della soglia rispetto alla segmentazione per l'identificazione cellulare ha anche permesso analisi più complesse, come esperimenti in cui sono stati analizzati contemporaneamente diversi tipi di cellule nelle cocolture. I fibroblasti NIH / 3T3, che spesso si trovano a colocalizzare con macrofagi RAW264.7 all'interno di un sito di guarigione delle ferite, sono stati trovati a crescere su un piano focale distinto dal piano focale dei macrofagi¹⁰. Di conseguenza, sono stati eseguiti più algoritmi di soglia per definire lo sfondo e il primo piano a seconda del tipo di cella analizzato, consentendo un conteggio accurato di due diversi tipi di celle all'interno della stessa immagine.

Protocollo

1. Coltura cellulare e acquisizione di immagini

1. Coltura di macrofagi RAW264.7 a 37 °C e 5% CO₂ nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina, 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 5 μM di β-mercaptoetanolo.
   1. Per l'imaging in monocoltura, coltivare cellule RAW264.7 ad una densità di 25.000 cellule/cm² in un pallone di coltura cellulare da 5 ml con 1 mL di terreno.
2. Coltura di cellule NIH/3T3 a 37 °C e 5% di CO₂ in DMEM integrate con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina-streptomicina¹¹.
3. Per l'imaging in cocoltura, coltura di macrofagi RAW264.7 e fibroblasti NIH/3T3 insieme a vari rapporti, ad una densità totale di 25.000 cellule/cm². Utilizzare un mezzo di cocoltura che è 1 parte di raw264,7 medio (DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina, 1,5 g / L bicarbonato di sodio e 5 μM β-mercaptoetanolo) e 1 parte NIH / 3T3 mezzo (DMEM integrato con 10% siero bovino fetale e 1% penicillina-streptomicina).
4. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO₂ per raggiungere una densità cellulare vitale dell'80% di confluenza cellulare.
5. Immagini di cellule con un microscopio invertito dotato di un obiettivo 40x. Acquisisci tutte le immagini in scala di grigi ed esportale nel file '.czi' grezzo.
   1. Determinare la capacità dell'algoritmo di valutare con precisione le immagini con una gamma di qualità dell'immagine. Acquisisci immagini con fuochi diversi, producendo sia immagini "non bulbose" (Figura 2) che immagini "bulbose" (Figura 3).
   2. Esporta e converti le immagini delle celle nel formato immagine tiff (.tiff) a 8 bit utilizzando ImageJ utilizzando la funzione 'Batch Convert' sui file raw '.czi' prima dell'analisi MATLAB. Archivia le immagini convertite in una cartella locale e trasferisci manualmente questi file di immagine nel contenitore MATLAB pertinente.

2. Analisi delle immagini-monocoltura utilizzando principalmente il file "monocultura.m"

NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando MATLAB. Per il protocollo MATLAB sono stati utilizzati tre file: "process.m" (File di codifica supplementare 1), il file contenente l'algoritmo, "monoculture.m" (File di codifica supplementare 2), il file da eseguire per l'analisi delle immagini di monocoltura e "coculture_modified.m" (File di codifica supplementare 3), il file da eseguire per l'analisi delle immagini di cocultura.

1. Utilizzare il metodo basato sull'area per ottenere immagini di celle che mostrano variazioni di altezza relative. Output di immagini per ogni sottostep utilizzando la funzione 'imshow()' per ogni sottoimmagine. Copiare e incollare il file di immagine per l'analisi nel cestino e immettere il nome del file nel comando seguente. Premere Esegui per avviare il programma.
   imread('nome file.tiff')
   1. Analizza le immagini "apertura per ricostruzione" seguita da "chiusura per ricostruzione" utilizzando le funzioni sorgente⁸ per ingrandire il primo piano dallo sfondo. Utilizzare il primo comando per l'apertura per ricostruzione e la seconda e la terza sequenza per chiudere per ricostruzione
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Binarizza le immagini ricostruite in pixel bianchi e neri puri utilizzando un sistema di identificazione basato su percentile. Si noti che le celle vengono convertite in un valore di pixel bianco puro di '255' in questo sistema, mentre gli oggetti di sfondo ed estranei (non cellulari) vengono convertiti in un valore di pixel nero puro di '0'.
   1. Distinguere le celle dallo sfondo utilizzando una differenza percentile dal "pixel massimo rilevante", il valore di pixel più grande che comprende almeno lo 0,5% di una determinata immagine.
   2. Analizzare e valutare i valori dei pixel per i macrofagi RAW264.7. Se questi valori sono compresi nel 4,5% del pixel massimo pertinente, contrassegnare il pixel come cellulare.
      NOTA: questo comando può essere emesso utilizzando una semplice istruzione if.
   3. Per le immagini contenenti profili cellulari bulbosi, come quelle viste nella Figura 2, implementare una procedura iterativa per correggere la binarizzazione errata al centro delle cellule (denominata "isole"; vedi sotto), come segue.
   4. Determinare un'ipotesi iniziale per la copertura totale della cella; Il 60% è stato utilizzato per questo studio. Si noti che il numero di cellule presenti all'interno dell'immagine dovrebbe dipendere dalla copertura cellulare: la relazione tra numero di cellule e copertura cellulare può quindi essere determinata sperimentalmente. Usando questa relazione, determina le variabili 'Alpha' e 'kappa'.
      NOTA: 'Alpha' rappresenta un vettore 3 x 1 contenente i seguenti percentili di altezza relativa: il percentile di altezza in cui sono state identificate le celle, il percentile di altezza in cui è stato identificato lo sfondo e il percentile di altezza in cui risiedevano isole-regioni in cui i valori di intensità erano significativamente inferiori ai valori delle celle. 'Kappa' rappresenta l'area totale coperta dalle celle nell'immagine.
   5. Esegui l'algoritmo, che (i) analizzerà le immagini utilizzando le stime iniziali di alfa e kappa per riempire una porzione delle isole e (ii) utilizzerà il conteggio e la copertura delle cellule postanalisi per ricalcolare kappa. Se il valore kappa è entro il 10% dell'ipotesi iniziale, procedere al passaggio successivo.
      NOTA: per le immagini contenenti cellule RAW264.7 e NIH/3T3, l'alfa è risultato essere [4.3, 5.5, 10]. In altre parole, una differenza del 4,3% dal pixel massimo rilevante ha determinato il percentile di altezza in cui sono state identificate le celle, una differenza del 5,5% dal pixel massimo rilevante ha determinato il percentile di altezza in cui è stato identificato lo sfondo. Una differenza del 10% dal pixel massimo rilevante ha determinato il percentile di altezza a cui le isole risiedevano tipicamente.
3. Dopo la binarizzazione dell'immagine, determinare automaticamente l'area media della cella utilizzando l'algoritmo di ricerca del cerchio open source, che esegue una trasformazione di Hough sull'immagine binaria 12,13,14. Utilizzare il comando seguente per ottenere un vettore di tutte le posizioni centrali e dei raggi dei cerchi trovati all'interno dell'immagine.
   '[centri, raggi] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])"
   'A' in questo comando è l'immagine scelta, e [minradius, maxradius] è l'intervallo di raggi che l'algoritmo tenterà di rilevare.
   NOTA: Questa procedura per determinare l'area cellulare media presuppone che la morfologia delle cellule macrofagiche fosse sia circolare che coerente tra le cellule¹⁰. Dai dati sperimentali, i raggi dei macrofagi sono osservati essere più comunemente tra 30 e 50 pixel con ingrandimento 40x. Questo intervallo di pixel è definito come l'intervallo accettabile per l'algoritmo di ricerca del cerchio. I raggi potrebbero essere significativamente diversi per altri tipi di cellule e richiederebbero la determinazione utilizzando l'analisi sperimentale.
   1. Utilizzare i raggi in uscita per calcolare l'area media della cella mediante la media. Analizzare almeno 10 celle per garantire un'identificazione accurata dell'area.
4. Determinare il numero totale di celle all'interno dell'immagine utilizzando l'area media della cella.
   1. Scorrere la matrice dell'immagine e contare il numero totale di pixel di cella. Determinare la copertura totale della cella dividendo il numero di pixel di cella per il numero totale di pixel all'interno dell'immagine. Determinare il numero totale di celle all'interno dell'immagine dividendo il numero di pixel di cella per l'area media di una cella.

3. Analisi delle immagini-cocultura che utilizza principalmente il file "coculture_modified.m"

NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando MATLAB.

1. Utilizzare il metodo basato sull'area per ottenere immagini di celle che mostrano variazioni di altezza relative. Output di immagini per ogni sottostep utilizzando la funzione 'imshow()' per ogni sottoimmagine. Copiare e incollare il file di immagine per l'analisi nel cestino e immettere il nome del file nel comando seguente. Premere Esegui per avviare il programma.
   'imread('nome file.tiff')'
   1. Analizza le immagini "aprendo per ricostruzione" seguito da "chiudendo per ricostruzione" utilizzando le funzioni sorgente¹⁰ per ingrandire il primo piano dallo sfondo. Utilizzare il primo comando per l'apertura per ricostruzione e la seconda e la terza sequenza per la chiusura per ricostruzione.
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Condurre un'analisi di cocolture contenenti cellule RAW264.7 e NIH/3T3 utilizzando due binarizzazioni selettive, ottenute sfruttando le differenze di altezza tra i due tipi cellulari.
   1. Determinare sperimentalmente un parametro 'phi' utilizzando immagini di celle RAW264.7 e NIH/3T3, con phi che rappresenta la differenza di altezza proporzionale tra i due tipi di cellule. Indovina un valore phi iniziale e ripeti fino a quando i conteggi delle cellule e la copertura non corrispondono strettamente ai conteggi manuali, specifici per la cocultura RAW264.7 e NIH / 3T3.
      NOTA: Il valore per phi utilizzato in questi studi è risultato essere 3,2. Phi viene utilizzato per filtrare selettivamente un'immagine in modo che sembri contenere solo celle RAW264.7, come mostrato nella Figura 4C.
   2. Determinare i conteggi delle cellule RAW264.7 e la copertura cellulare totale in modo simile a quello delle immagini di monocoltura.
3. Analizza nuovamente l'immagine trasformata nello spartiacque senza il parametro phi, rilevando sia i macrofagi che i fibroblasti. Acquisire i dati dei fibroblasti NIH/3T3 sottraendo selettivamente i pixel delle cellule RAW264.7, ottenuti utilizzando i metodi standard di soglia e quantificazione basati sull'area descritti nella fase 2.
   1. Una volta analizzata l'intera immagine, determinare il numero totale di pixel NIH/3T3 sottraendo il numero totale di pixel di cella dal numero di pixel RAW264.7. Calcolare la copertura delle celle NIH/3T3 e RAW264.7 dividendo per il numero di pixel di cella per ogni linea di cella per il numero totale di pixel dell'immagine.

Risultati

L'analisi dei macrofagi RAW264.7 non bulbosi è stata condotta in un ambiente di monocoltura a 25.000 cellule / cm². Sono state scattate immagini rappresentative della coltura cellulare ed elaborate in MATLAB dopo la conversione in tiff a 8 bit in ImageJ. Gli output dell'algoritmo durante tutto il processo sono stati registrati e documentati nella Figura 2 per l'immagine rappresentativa. In questa immagine, l'algoritmo ha contato 226 celle e questo conteggio delle immagini è stat...

Discussione

Abbiamo progettato una procedura generale basata sull'area che contava in modo accurato ed efficiente le cellule sulla base dell'altezza delle cellule, consentendo una quantificazione senza macchie delle cellule anche nei sistemi di cocoltura. I passaggi critici per questa procedura includevano l'implementazione di un sistema di intensità relativa mediante il quale le cellule potevano essere differenziate. L'uso di un'analisi dell'altezza relativa serviva a due scopi: la necessità di parametri esterni era resa superflu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA