Ex Vivo Perfusione epatica attraverso la vena porta nel topo

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo semplice di resezione di un fegato di topo intatto per studi metabolici attraverso la perfusione della vena porta.

Abstract

Le malattie metaboliche come il diabete, il pre-diabete, la steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e la steatoepatite non alcolica (NASH) stanno diventando sempre più comuni. Le perfusioni epatiche ex vivo consentono un'analisi completa del metabolismo epatico utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR), in condizioni nutrizionali che possono essere rigorosamente controllate. Poiché le simulazioni in silico rimangono un mezzo principalmente teorico per valutare le azioni ormonali e gli effetti dell'intervento farmaceutico, il fegato perfuso rimane uno dei banchi di prova più preziosi per comprendere il metabolismo epatico. Poiché questi studi guidano le intuizioni di base sulla fisiologia epatica, i risultati devono essere accurati e riproducibili. Il più grande fattore nella riproducibilità della perfusione epatica ex vivo è la qualità della chirurgia. Pertanto, abbiamo introdotto un metodo organizzato e semplificato per eseguire perfusioni epatiche di topo ex vivo nel contesto di esperimenti NMR in situ . Descriviamo anche un'applicazione unica e discutiamo i problemi comuni riscontrati in questi studi. Lo scopo generale è quello di fornire una guida semplice a una tecnica che abbiamo perfezionato nel corso di diversi anni che riteniamo il golden standard per ottenere risultati riproducibili in resezioni epatiche e perfusioni nel contesto di esperimenti NMR in situ . La distanza dal centro del campo per il magnete e l'inaccessibilità del tessuto all'intervento durante l'esperimento NMR rende i nostri metodi nuovi.

Introduzione

Le perfusioni ex vivo sono cruciali nello studio del metabolismo epatico e la perfusione attraverso la vena porta è lo standard per questi studi. Per studiare il metabolismo epatico in isolamento, il fegato deve essere resecato dal corpo per evitare complicazioni derivanti dal metabolismo in altri organi (cioè il metabolismo di tutto il corpo) e per esercitare il controllo sulla disponibilità ormonale (insulina, glucagone, ecc.). Questo approccio può essere essenziale per comprendere gli effetti di malattie come il diabete, la NAFLD e la NASH sul metabolismo epatico e sui meccanismi di azione dei farmaci. Questo articolo serve come guida per la resezione epatica e la perfusione. Abbiamo sviluppato una procedura semplificata per eseguire questi studi metabolici sul fegato con sufficiente rigore e riproducibilità. Se l'intervento chirurgico non viene eseguito correttamente, vi è una pronunciata variabilità nei dati metabolici ottenuti. Descriviamo un metodo organizzato per eseguire il cateterismo della vena porta e la resezione epatica nel contesto di studi metabolici in situ in uno spettrometro a risonanza magnetica nucleare (NMR), come descritto nella letteratura 1,2,3,4,5.

Attualmente, non esiste letteratura che descriva una perfusione epatica ex vivo utilizzando una colonna di vetro all'interno di una NMR. Né esiste una pubblicazione video o testuale che fornisca un chiaro esempio di come eseguire la procedura con il fegato di topo, in particolare, dimostrando come cateterizzare la vena porta, resecare un fegato, trasferire e appendere il fegato su una colonna di vetro. Poiché il topo geneticamente modificato è onnipresente per studiare il metabolismo epatico, questa è una procedura essenziale che merita una descrizione completa. Gli interventi chirurgici di perfusione epatica non sono nuovi, ma questo articolo è un metodo gold standard accompagnato da un video che dimostra l'eccellenza tecnica descritta in questo documento per aiutare tutti coloro che sono interessati a questa procedura. Il metodo qui presentato sarebbe meglio applicato al metabolismo in tempo reale per rilevare la funzione e il turnover dei metaboliti nei modelli di malattia.

Questo metodo utilizza una colonna di vetro rivestita d'acqua di 100 cm, che consente al fegato di appendersi sul fondo della cannula incapsulata da perfusate all'interno di un tubo NMR. L'acqua riscaldata nella camicia di vetro viene utilizzata per controllare la temperatura di perfusazione. Un ossigenatore a strato sottile viene pressurizzato con 95%/5% O₂/CO_{2 per il} controllo del pH. Utilizzando tre pompe separate, viene impostata l'altezza della colonna di perfusato, che fornisce una pressione costante al fegato. Le portate non sono controllate oltre l'applicazione della pressione costante (Figura 1). Per confermare che il fegato funzioni in modo appropriato, vengono effettuate misurazioni dell'ossigeno insieme alle portate. Nelle nostre mani, questo insieme di precondizioni porta a esperimenti NMR altamente ripetibili per la valutazione della funzione metabolica epatica.

Protocollo

Gli esperimenti che hanno coinvolto topi sono stati gestiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida (numero di protocollo n. 201909320). Il ceppo di topo utilizzato era C57BL/6J; tutti i topi erano maschi. Questo metodo è generalmente applicabile anche per gli studi che utilizzano altri ceppi di topo standard. Questo intervento chirurgico viene eseguito in modo ottimale da due individui che lavorano insieme.

1. Configurazione iniziale

1. Perfusare fegati con perfusato contenente elettroliti Krebs-Henseleit⁶ (25 mM NaHCO₃, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM ciascuno di MgSO₄, KH₂PO₄ e 0,5 mM sodio-EDTA, 1,25 mM CaCl₂), 6 mM lattato di sodio, 0,6 mM piruvato di sodio, 0,2 mM [^U-13C] propionato di sodio, 10% (v/v) D₂O, e 0,63 mM di acidi grassi misti (contenenti acido palmitico (22,1% del totale), acido palmitoleico (5,2%), acido stearico (2,7%), acido oleico (27%), acido linoleico (37,7%), acido γ-linolenico (2,4%) e acido decosaesanoico (2,8%)) insieme al 2% (p/v) di albumina sierica bovina. Impostare il pH finale del perfusato a 7,3 utilizzando HCl (e NaOH, se necessario).

2. Configurazione pre-operatoria

1. Assemblare due siringhe da 1 mL con un ago da 23G lunghe 19,05 mm. Riempire una siringa con 0,01 mL di 1000 unità/mL di eparina e 0,19 mL di soluzione salina (0,9% (p/v) di NaCl in acqua; Tabella 1).
2. Riempire la seconda siringa con 0,2 mL di lidocaina al 2% e 0,6 ml di soluzione salina allo 0,9% (Tabella 1). In un'altra siringa da 1 mL con un ago da 27 G e 38,1 mm, riempire con il perfusato e mantenere a 37 °C.

3. Impostazione della colonna perfusare

1. Introdurre la bottiglia di vetro contenente 500 ml di perfusato nel bagno d'acqua (Figura 1B). Accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura a ~42 °C. La temperatura più elevata nel bagno d'acqua consente di mantenere 37 °C nella colonna di perfusione.
2. Una volta che l'acqua si riscalda fino a 42 °C, accendere le due pompe per far circolare il perfusato dalla bottiglia attraverso l'ossigenatore a film sottile e la colonna di vetro da 100 cm rivestita d'acqua (Figura 1A-E).
3. Accendere il gas ossigenante (95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica) per pressurizzare l'ossigenatore⁷ (Figura 1C). Regolare l'altezza della colonna perfusare per ottenere una portata di 8 mL/min con il catetere collegato (vedere il passaggio 9 per la misurazione della portata)^5,8,9.
   NOTA: La portata si riferisce alla velocità con cui il perfusato viene espulso dal fegato.

4. Anestesia del mouse

1. Indossare DPI come richiesto dal protocollo IACUC e da altre linee guida di sicurezza appropriate.
   NOTA: i seguenti passaggi sono stati ottimizzati per i mouse di età compresa tra 9 e 13 settimane.
2. Posizionare il mouse nella camera isoflurano. Portare il gas di mandata al 100% di ossigeno, una portata di 1 L/min e l'isoflurano al 2%¹⁰. Aspetta che la respirazione rallenti e sia costante.
   NOTA: Affinché il topo raggiunga un piano chirurgico stabile, come evidenziato da una frequenza respiratoria lenta e costante e dalla mancanza di riflesso del pizzico della punta, la portata di ossigeno può essere regolata a ~ 1,5 L / min a ~ 3 L / min e la concentrazione di isoflurano dall'1 al 3%. Il tasso di consegna del gas di trasporto e della concentrazione di isoflurano dipende dall'età e dal peso dell'animale e da fattori quali il rumore e la luce.
3. Disinfettare l'addome con alcol al 70%. Somministrare eparina attraverso un'iniezione sottocutanea profonda nello strato di grasso addominale (Figura 2). Riposizionare il mouse nella camera di anestesia per 10 minuti.
   NOTA: la rasatura non è necessaria in quanto questa procedura è terminale.

5. Celiotomia

1. Trasferire il topo dalla camera di anestesia alla piattaforma chirurgica e posizionarlo in posizione supina (Figura 3).
2. Metti il naso del topo in un cono nasale e fissa le zampe verso il basso. Fare attenzione a non applicare alcuna tensione sul collo che possa portare al soffocamento.
3. Somministrare lidocaina attraverso un'iniezione sottocutanea bilateralmente nella regione¹¹ della cresta iliaca anteriore (Figura 3). Eseguire un test di pizzicamento della punta per confermare l'assenza di tutti i riflessi del dolore.
4. Eseguire la celiotomia per esporre gli organi interni (Figura 4). Fai un'incisione larga 3 cm (la larghezza dell'intero addome del mouse).
   NOTA: la larghezza cambierà con l'età e la dieta del mouse.
5. Espandere l'incisione utilizzando un emostato che tira la trazione bloccando il processo xifoide (Figura 4).

6. Cannulazione della vena porta

1. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per eliminare l'intestino tenue e crasso che copre la vena porta. Posizionare una sutura di seta sotto l'arco della vena porta prossimale al fegato (Figura 4A).
2. A seconda della struttura anatomica, posizionare la seconda sutura di seta prossimale o distale della vena mesenterica inferiore distale dal fegato (Figura 4A)^12,13. Utilizzare una sutura 2-0 per entrambe le suture.
3. Una volta che le suture sono in posizione, cannulare la vena porta con un catetere 22G¹⁴ (Figura 4B). Quando si inserisce il catetere, tenere la smussatura puntata verso l'alto. Inserire la vena porta con un angolo non superiore a 15°.
4. Legare la prima sutura oltre il tapper del catetere. Dopo che la vena porta è stata cannulata, ancorare il catetere 2-3 mm distale dal ramo della vena porta con la sutura di seta (Figura 4B).
   NOTA: L'assistente deve rotolare spalle e polsi per evitare lo spostamento del catetere o la lacerazione della vena porta. Ogni sutura richiede due nodi.
5. Quindi, fissare la parte inferiore del catetere con la seconda sutura. Con l'aiuto dell'assistente chirurgico, legare un nodo con la sutura per fissare il catetere alla porzione distale della vena porta e del tessuto circostante.

7. Resezione della cannulazione della vena porta post-epatica

1. Dopo aver fissato il catetere, inserire una siringa da 1 mL con un ago da 27 G lungo 38,1 mm nel catetere per lavare il sangue e le bolle d'aria.
   NOTA: Di solito c'è un riflusso di sangue dal catetere dalla pressione.
2. Utilizzare un tubo in silicone ID x 5 mm O.D. con un rubinetto fisso per accoppiare la colonna di perfusione (Figura 1A) al catetere consentendo il flusso del tampone nel fegato che segna l'inizio della perfusione. Avviare un timer a questo punto per contrassegnare l'inizio della perfusione.
3. Alleviare l'aumento della pressione vascolare facendo un'incisione, usando le forbici, nella vena cava inferiore.
4. Confermare il flusso di perfusate attraverso il fegato osservando il cambiamento omogeneo nel colore del fegato da rosa / rosso a un giallo pallido. Una volta confermato il flusso, asportare lo stomaco, l'intestino tenue, l'intestino crasso e il rene destro dal tessuto circostante.
5. Con l'aiuto dell'assistente chirurgico, manovrare il fegato intorno alla cavità addominale e toracica mentre il chirurgo taglia il peritoneo parietale e il tessuto toracico per resecare il fegato
6. Infine, sollevare il fegato verso l'alto e tagliare i tessuti connettivi rimanenti che tengono il fegato in posizione con le forbici. Manipolare lentamente il fegato per facilità di visione. Rimuovere qualsiasi pelliccia che si attacca al fegato risciacquando con perfusato prima di incapsularlo all'interno del tubo NMR.
   NOTA: In questa procedura, viene rimosso solo il fegato. Tutti gli altri organi sono lasciati nel corpo dell'animale. Il dotto biliare può essere rimosso in base al protocollo dell'esperimento. Anche se per questo esperimento, è stato lasciato sul posto.

8. Appendere il fegato alla colonna

1. Una volta che il chirurgo consegna il fegato e il tubo all'assistente, l'assistente scollega il tubo dal catetere e dalla colonna.
2. Riempire il catetere con perfusato fino a formare un menisco sulla parte superiore del catetere. Attaccare il catetere alla colonna affinché il fegato si appenda e si perfonda.
   NOTA: Il tallone di perfusato sul catetere fornisce un volume sufficiente per il fegato per funzionare fino a quando non è collegato. Il catetere attaccato al fegato viene premuto montato sul fondo della colonna.
3. Avvitare un tubo NMR da 20 mm sulla colonna di vetro da 100 cm per incapsulare il fegato (Figura 5). Per evitare la torsione del fegato e della vena porta, avvitare lentamente il tubo NMR. Se si verifica una torsione e il flusso viene interrotto, svitare e risevitare il tubo NMR. Questo rimedierà all'occlusione e il flusso tornerà.
4. Perfondere il fegato per 30-60 minuti in base ai dettagli dello studio.
   NOTA: il tempo si basa sull'esperimento di perfusione. Per questo esperimento, il turnover metabolico è stato misurato entro 30 minuti. La perfusione epatica può richiedere fino a 10 minuti per raggiungere uno stato stazionario. Il tempo allo stato stazionario inizia una volta che la vena cava inferiore è stata tagliata e il flusso epatico è stato stabilito.

9. Misurazione del flusso

1. Posizionare una barca pesata su una bilancia a carico dall'alto e azzerare la bilancia. Posizionare il tubo dalla pompa a rulli che tira il perfusato efferente dalla NMR nella barca di pesatura e avviare il timer.
2. Pesare la massa di liquido accumulato in 1 minuto che produce la portata del fegato. Riposizionare il tubo nel contenitore dei rifiuti/raccolta.

10. Misurazione dell'ossigeno

NOTA: le misurazioni del misuratore di ossigeno sono state impostate secondo le istruzioni del produttore¹⁵.

1. Posizionare l'elettrodo contenente 20 μL di soluzione satura al 50% di KCl sulla cupola di platino e posizionare cinque gocce da 10 μL attorno all'anello di platino inferiore dell'elettrodo.
2. Rimuovere l'adesivo dalla carta da sigarette. Posare un pezzo di membrana di politetrafluoroetilene sulla carta da sigarette.
3. Posizionare i due pezzi sopra l'elettrodo. Montare un piccolo O-ring attorno alla parte superiore dell'elettrodo. Tagliare la carta per appoggiarla sull'anello di platino inferiore sull'elettrodo.
   NOTA: alcune sporgenze sono accettabili. È essenziale coprire l'argento dell'elettrodo.
4. Posizionare l'O-ring più grande sull'elettrodo. Accoppiare l'elettrodo alla camera dell'acqua e stringere la base per mantenere l'elettrodo in posizione. Accendere il bagno d'acqua e lasciare riscaldare fino a 37 °C.
5. Apri il software del misuratore di ossigeno. Fare clic su Calibra > acqua satura d'aria. Impostare la velocità dell'agitatore a 75 e la temperatura a 37 °C.
6. Riempire un flaconcino da 50 ml a metà con acqua e agitare vigorosamente per 2 minuti. Questa è acqua satura d'aria, usala come standard al 100%. Riempire la camera del misuratore di ossigeno con ~ 2 ml di acqua e posizionare il tappo a due pezzi.
7. Fare clic su OK sullo schermo e consentire al segnale di stabilizzarsi. Una volta che il segnale ha raggiunto un plateau, fare clic su OK. Smaltire il liquido nella camera e asciugare con carta velina.
8. Ripetere i passaggi 10,6-10,7 ma con 200 mM di solfito di sodio (0% standard). Fare clic su Salva calibrazione.
   NOTA: non è necessario un vigoroso scuotimento per lo standard 0%.
9. Durante la perfusione, utilizzare due siringhe da 5 ml. Una siringa per il perfusato circolante (ossigeno in entrata) e la seconda per il perfusato efferente dal tubo NMR (ossigeno in uscita).
10. Durante la stesura del perfusare sia per le misurazioni in entrata che in uscita, disegnare 3-4 ml ogni volta.
    NOTA: questa colonna ha un tubo di vetro per consentire l'accesso al tubo NMR per prelevare il perfusato che è fluito attraverso il fegato.
11. Misurare il perfusato circolante, prima proprio come acqua nel passaggio 10.6 e smaltire nel passaggio 10.7. Ripeti gli stessi passaggi per il perfusato efferente.
12. Eseguire misurazioni dell'ossigeno ogni 10 minuti.

Risultati

La funzionalità epatica è valutata principalmente dal consumo di ossigeno e dalla portata. Una portata di 4-8 ml/min e un consumo di ossigeno di 1 μmol/min.g sono tipici. Queste misure varieranno a seconda delle specifiche condizioni sperimentali e delle differenze biologiche.

La quantità esatta di isoflurano utilizzata dipenderà dal tipo di sistema di anestesia utilizzato, nonché dall'ambiente e dall'età/peso del mouse. Durante l'intervento chirurgico, l'isoflurano e il gas di mandata ...

Discussione

Questa procedura chirurgica è impegnativa e richiede una pratica approfondita per ottenere risultati riproducibili. L'isoflurano e il gas di trasporto devono essere regolati secondo necessità per mantenere la vitalità dell'animale attraverso la maggior parte della procedura chirurgica possibile. L'ambiente, l'ora del giorno, l'età, il peso e molti altri fattori influenzeranno l'anestesia. Il peso, la dieta, il ceppo dei topi e l'età potrebbero influenzare la chirurgia poiché l'accumulo di grasso può interferire co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand