Un nuovo modello di ferita della pelle ovina ex vivo ad alta produttività per testare antibiotici emergenti

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per impostare un modello di pelle ferita ovina ex vivo infettata da Staphylococcus aureus. Questo modello ad alto rendimento simula meglio le infezioni in vivo rispetto alle tecniche di microbiologia convenzionali e presenta ai ricercatori una piattaforma fisiologicamente rilevante per testare l'efficacia degli antimicrobici emergenti.

Abstract

Lo sviluppo di antimicrobici è un processo costoso con tassi di successo sempre più bassi, il che rende meno attraenti ulteriori investimenti nella ricerca sulla scoperta di antimicrobici. La scoperta di farmaci antimicrobici e la successiva commercializzazione possono essere rese più redditizie se un approccio fail-fast-and-fail-cheap può essere implementato all'interno delle fasi di ottimizzazione del piombo in cui i ricercatori hanno un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci. In questo articolo, viene descritta la configurazione di un modello di pelle ferita ovina ex vivo infettata da Staphylococcus aureus, che è semplice, economica, ad alta produttività e riproducibile. La fisiologia batterica nel modello imita che durante l'infezione come proliferazione batterica dipende dalla capacità del patogeno di danneggiare il tessuto. L'instaurazione dell'infezione della ferita è verificata da un aumento della conta batterica vitale rispetto all'inoculo. Questo modello può essere utilizzato come piattaforma per testare l'efficacia degli antimicrobici emergenti nella fase di ottimizzazione del piombo. Si può sostenere che la disponibilità di questo modello fornirà ai ricercatori che sviluppano antimicrobici un modello fail-fast-and-fail-cheap, che contribuirà ad aumentare i tassi di successo nelle successive sperimentazioni sugli animali. Il modello faciliterà inoltre la riduzione e il perfezionamento dell'uso animale per la ricerca e, in ultima analisi, consentirà una traduzione più rapida ed economica di nuovi antimicrobici per le infezioni della pelle e dei tessuti molli in clinica.

Introduzione

Le infezioni della pelle sono un importante problema globale, con grandi costi economici per gli operatori sanitari di tutto il mondo. Lo sviluppo della resistenza multifarmaco e la formazione di biofilm da parte di agenti patogeni gioca un ruolo chiave nella prevalenza di ferite non cicatrizzanti 1,2,3,4. Di conseguenza, le infezioni della pelle e dei tessuti molli sono uno dei motivi più comuni per il ricovero prolungato e la successiva riammissione⁵. I ritardi nella guarigione delle ferite sono costosi sia per il paziente che per gli operatori sanitari, con alcune stime che suggeriscono che circa 6,5 milioni di pazienti sono colpiti ogni anno negli Stati Uniti. Nel Regno Unito, le infezioni della pelle e le complicanze associate provocano circa 75.000 decessi all'anno ^2,4,6.

Lo Staphylococcus aureus (S. aureus) è un formidabile patogeno della ferita spesso isolato dalle ferite del paziente ^2,7. Il tasso di comparsa della resistenza multifarmaco è aumentato drasticamente negli anni 2000. Durante questo periodo, circa il 60% delle infezioni batteriche acute della pelle e della struttura della pelle erano positive alla coltura per S. aureus 1 resistente alla meticillina. Il crescente numero di ceppi multiresistenti tra gli stafilococchi e altri agenti patogeni negli ultimi 2 decenni indica un urgente bisogno di un rapido sviluppo di antibiotici con nuove modalità di azione in grado di superare la resistenza.

Tuttavia, dai primi anni 2000, i programmi di scoperta degli antibiotici sono stati dominati da tempi di sviluppo più lunghi e bassi tassi di successo, con solo il 17% dei nuovi antibiotici che entrano negli studi clinici negli Stati Uniti ottenendo l'approvazione del mercato⁸. Ciò suggerisce una disparità tra i risultati dei test in vitro sugli antibiotici emergenti e i loro risultati clinici. Si può sostenere che questa disparità è in gran parte dovuta alle differenze nella fisiologia batterica durante le infezioni in vivo e durante i metodi microbiologici convenzionali quando si verifica l'efficacia degli antibiotici nelle fasi precliniche in vitro . Pertanto, sono necessari nuovi metodi di laboratorio che siano più rappresentativi della fisiologia batterica durante l'infezione per migliorare le percentuali di successo nei programmi di scoperta di antibiotici.

I metodi attuali per studiare le infezioni cutanee includono studi su animali vivi (ad esempio, topi), modelli cutanei ex vivo (ad esempio, suini) e modelli cutanei 3D di ingegneria tissutale (ad esempio, umano)9,10,11,12. Gli studi su animali vivi sono strettamente regolamentati e hanno una produttività relativamente bassa. Nei modelli animali, ferite e infezioni causano disagio significativo agli animali e sollevano preoccupazioni etiche. I modelli di pelle umana, ex vivo o di ingegneria tissutale, richiedono l'approvazione etica, la conformità alla legislazione locale e globale (la legge sui tessuti umani, la dichiarazione di Helsinki) e vi è difficoltà nell'acquisizione di tessuti, con alcune richieste che richiedono anni per soddisfare^13,14. Entrambi i tipi di modello sono ad alta intensità di manodopera e richiedono competenze significative per garantire il successo sperimentale. Alcuni attuali modelli di infezione cutanea ex vivo richiedono dischi pre-inoculati e additivi per il letto della ferita per consentire l'infezione; Sebbene questi modelli siano incredibilmente utili, ci sono limitazioni nel processo di infezione in quanto gli additivi limitano l'utilizzo del letto della ferita come fonte di nutrienti^10,15,16,17. Il modello descritto in questo studio non utilizza additivi per il letto della ferita, il che garantisce che la patologia dell'infezione e la conta delle cellule vitali siano il risultato dell'utilizzo diretto del letto della ferita come unica fonte di nutrienti.

Data la necessità di nuovi metodi di laboratorio, è stato sviluppato un nuovo modello ex vivo di infezioni cutanee ovine, ad alto rendimento, da utilizzare nella valutazione dell'efficacia degli antibiotici emergenti. Gli studi sulle infezioni della pelle affrontano molte sfide: costi elevati, preoccupazioni etiche e modelli che non mostrano un quadro completo^20,21. I modelli ex vivo e i modelli di espianto 3D consentono una migliore visualizzazione del processo patologico e dell'impatto che i trattamenti possono avere da un modello clinicamente più rilevante. Qui viene descritta la configurazione di un nuovo modello di pelle ovina, che è semplice, riproducibile e clinicamente rilevante e ha un alto rendimento. La pelle ovina è stata scelta poiché le pecore sono uno dei grandi mammiferi comunemente usati per modellare le risposte alle infezioni in vivo. Inoltre, sono facilmente reperibili dai macelli, garantendo una fornitura costante di pelle per la ricerca, e le loro carcasse non sono scottate, garantendo una buona qualità dei tessuti. Questo studio ha utilizzato S. aureus come patogeno esemplare; Tuttavia, il modello funziona bene con altri microrganismi.

Protocollo

Le teste di agnello del macello R.B Elliott and Son sono state utilizzate come fonte di campioni di pelle in questo progetto. Tutti gli agnelli venivano macellati per il consumo come cibo. Invece di scartare le teste, queste sono state riproposte per la ricerca. L'approvazione etica non era richiesta in quanto il tessuto proveniva da rifiuti scartati dai macelli.

1. Sterilizzazione

1. Disinfettare le pinze prima della raccolta delle teste prendendo una pinza pulita ed eseguendo la sterilizzazione a calore secco in un forno a 200 °C per 1 ora. Autoclavare tutti i bicchieri a 121 °C per 15 minuti prima dell'uso.
2. Eseguire tutto il lavoro descritto all'interno di un armadio di classe 2 di microbiologia. Preparare tutti i reagenti secondo le istruzioni del produttore.

2. Raccolta dei campioni

1. Nel mattatoio, gli agnelli di Swaledale venivano macellati mediante stordimento usando l'elettricità o una pistola prigioniera ed essanguati. Raccogliere le teste di agnello non più di 4 ore dopo la macellazione.

3. Preparazione delle teste

1. Disinfettare la sezione frontale dell'agnello versando circa 100 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm sull'area del campione. Rasare la sezione frontale della testa con tagliatrici elettriche e lavare l'area con 200 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm.
2. Pulire l'area con etanolo e rotolo blu e coprire l'area del campione con crema depilatoria per 35 minuti. Raschiare delicatamente la crema depilatoria utilizzando uno strumento raschiante e valutare l'area del campione. Se rimane una quantità significativa di peli, ripetere il processo di depilazione.
3. Utilizzare altri 200 ml di soluzione di biossido di cloro per risciacquare l'area, quindi risciacquare con etanolo e pulire con un rotolo blu.
4. Utilizzando un punch bioptico sterile da 8 mm, ritagliare campioni di pelle da 8 mm dall'area preparata. Rimuovere i campioni utilizzando una pinza sterile e un bisturi a 15 lame, assicurando che tutto il grasso cutaneo venga rimosso.
5. Mettere i campioni in un barattolo sterile da 0,5 L riempito con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), quindi trasferirli in provette sterili da 50 ml con 50 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm, capovolgere due volte e lasciare sterilizzare per 30 minuti.
6. Rimuovere i campioni dalla soluzione di biossido di cloro e lavarli mettendoli in una provetta da 50 mL riempita con 40 mL di PBS sterile. Una volta lavato, posizionare ogni singolo campione di pelle in un pozzetto separato di una piastra da 24 pozzetti.
7. Aggiungere 350 μL di mezzo preriscaldato mantenendo il campione all'interfaccia aria-liquido. La composizione dei terreni è la seguente: terreni MK (Medium 199 con sali di Hanks, L-glutammato e 1,75 mg/mL di bicarbonato di sodio) e F12 di Ham in rapporto 1:1, con aggiunta di FBS (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicillina-streptomicina (100 U/mL) e amfotericina B (2,5 μg/mL).
8. Sigillare le piastre a 24 pozzetti con una guarnizione a piastre permeabile ai gas e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO₂ per un massimo di 24 ore.

4. Mantenimento dei campioni di pelle

1. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare i campioni in 500 μL di PBS sterile. Aggiungere terreni privi di antibiotici a ciascun campione e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO₂ per 24 ore per rimuovere gli antibiotici residui nel campione.
2. Se la torbidità o l'infezione fungina si sviluppano nei mezzi privi di antibiotici dopo 24 ore, scartare il campione.

5. Preparazione dell'inoculo

1. Preparare un tubo da 50 ml con 10 ml di brodo di soia triptico sterile. Prendi un piatto di agar fresco di S. aureus e usa un tampone per trasferire diverse colonie nel brodo. Incubare per 18 h a 37 °C a 150 giri/min.
2. Centrifugare a 4.000 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di PBS sterile. Ripetere due volte per garantire un adeguato lavaggio delle cellule.
3. Regolare l'inoculo a 0,6 OD₆₀₀ in PBS sterile. Confermare il carico dell'inoculo eseguendo un conteggio manuale delle piastre vitali.

6. Infezione di campioni di pelle

1. Preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con 400 μL di terreno privo di antibiotici preriscaldato e aggiungere gli inserti a 24 pozzetti usando una pinza sterile.
2. Rimuovere il terreno dai campioni di pelle, lavare con 500 μL di PBS sterile e rimuovere il lavaggio. Utilizzare una pinza sterile per tenere delicatamente il campione sul fondo del pozzetto.
3. Utilizzare una biopsia di 4 mm per creare un lembo centrale della ferita, perforando fino a una profondità approssimativa di 1-2 mm. Quindi, utilizzare un bisturi a 15 lame e una pinza sterile dentata in tessuto allis per rimuovere lo strato superiore del lembo della ferita. La variabilità delle dimensioni della ferita può influenzare l'esito dell'infezione e le unità formanti colonie endpoint (CFU).
4. Una volta che tutti i campioni sono stati feriti, trasferirli negli inserti a 24 pozzetti usando una pinza sterile. Pipettare 15 μL dell'inoculo batterico nel letto della ferita. Quindi, incubare per 24 ore a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO₂ .
5. Se sono necessari periodi di incubazione più lunghi, rimuovere il terreno e sostituirlo con terreno fresco ogni 24 ore e incubare nelle stesse condizioni.

7. Determinazione della carica batterica

1. Rimuovere il supporto dal fondo dei pozzi. Con una pinza sterile, trasferire ciascun campione in una provetta separata da 50 ml riempita con 1 mL di PBS sterile.
2. Utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per omogeneizzare la superficie del campione. Fare attenzione a garantire che il letto della ferita sia a diretto contatto con la punta dell'omogeneizzatore.
3. Omogeneizzare ogni campione per 35 s su medio/alto. L'omogeneizzatore stacca i batteri dalla superficie del letto della ferita per consentire l'enumerazione della carica batterica.
4. Una volta elaborati tutti i campioni, eseguire a turno il pipettaggio di ciascun campione, a turno. Questo per garantire che l'omogenato batterico sia miscelato.
5. Pipettare 20 μL di omogenato a vortice nel pozzetto corrispondente di una piastra da 96 pozzetti contenente 180 μL di PBS sterile.
6. Diluire in serie ciascun omogenato di campione a 1 x 10⁻⁷ e pipettare 10 μL di omogenato diluito su una piastra triplice di agar di soia triplice.
7. Incubare la piastra di agar per 18 ore a 37 °C. Quindi, contare il numero di colonie per determinare il CFU per ciascun campione.

Risultati

L'identificazione di un percorso per sterilizzare la pelle prima di impostare il modello di infezione della ferita è stata impegnativa. La sfida consisteva nel sterilizzare la pelle senza danneggiare i diversi strati cutanei, che possono quindi avere conseguenze indesiderate nell'esito dell'infezione. Per identificare un regime di sterilizzazione appropriato, sono stati provati diversi trattamenti per periodi di tempo variabili, come indicato nella Tabella 1. La contaminazione è stata registrata come l...

Discussione

Lo sviluppo di antimicrobici è un'impresa importante ma costosa che si stima costi circa 1 miliardo di dollari e richieda circa 15 anni per essere completata. Oltre il 90% della scoperta di farmaci antimicrobici e degli studi preclinici sull'efficacia dei farmaci antimicrobici sono condotti da ricercatori accademici e piccole e medie imprese con in genere meno di 50 dipendenti²². Questi team sono molto vincolati finanziariamente, il che rende disastroso il fallimento delle molecole guida nelle fa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX