Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica

Riepilogo

L'elettroporazione degli organoidi cerebrali dei primati fornisce un approccio preciso ed efficiente per introdurre modificazioni genetiche transitorie in diversi tipi di progenitori e neuroni in un sistema modello vicino allo sviluppo della neocorteccia (pato)fisiologica dei primati. Ciò consente lo studio dei processi neuroevolutivi e di sviluppo e può essere applicato anche per la modellizzazione delle malattie.

Abstract

La corteccia cerebrale è la struttura cerebrale più esterna ed è responsabile dell'elaborazione degli input sensoriali e dell'output motorio; È visto come la sede delle abilità cognitive di ordine superiore nei mammiferi, in particolare nei primati. Lo studio delle funzioni geniche nel cervello dei primati è impegnativo per ragioni tecniche ed etiche, ma l'istituzione della tecnologia degli organoidi cerebrali ha permesso lo studio dello sviluppo del cervello in modelli tradizionali di primati (ad esempio, macaco rhesus e uistitì comune), nonché in specie di primati precedentemente inaccessibili sperimentalmente (ad esempio, grandi scimmie), in un sistema eticamente giustificabile e meno tecnicamente impegnativo. Inoltre, gli organoidi cerebrali umani consentono l'indagine avanzata dei disturbi neurologici e dello sviluppo neurologico.

Poiché gli organoidi cerebrali ricapitolano molti processi di sviluppo del cervello, rappresentano anche un potente strumento per identificare le differenze e confrontare funzionalmente i determinanti genetici alla base dello sviluppo cerebrale di varie specie in un contesto evolutivo. Un grande vantaggio dell'utilizzo di organoidi è la possibilità di introdurre modificazioni genetiche, che consentono di testare le funzioni geniche. Tuttavia, l'introduzione di tali modifiche è laboriosa e costosa. Questo articolo descrive un approccio rapido ed economico per modificare geneticamente le popolazioni cellulari all'interno delle strutture simili a ventricole degli organoidi cerebrali dei primati, un sottotipo di organoidi cerebrali. Questo metodo combina un protocollo modificato per la generazione affidabile di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) umane, scimpanzé, macaco rhesus e comuni derivate da uistitì con un approccio di microiniezione ed elettroporazione. Ciò fornisce uno strumento efficace per lo studio dei processi neuroevolutivi e di sviluppo che può essere applicato anche per la modellizzazione delle malattie.

Introduzione

Studiare lo sviluppo (pato)fisiologico e l'evoluzione della corteccia cerebrale è un compito formidabile che è ostacolato dalla mancanza di sistemi modello adeguati. In precedenza, tali studi erano limitati a modelli di coltura cellulare bidimensionale (come il progenitore neurale primario o le colture cellulari neuronali) e modelli animali evolutivamente distanti (come i roditori)^1,2. Mentre questi modelli sono utili per affrontare alcune domande, sono limitati nel modellare la complessità, la composizione del tipo di cellula, l'architettura cellulare e i modelli di espressione genica della neocorteccia umana....

Protocollo

1. Coltura delle iPSC dei primati

NOTA: Grazie alla sua robustezza, il metodo qui presentato può essere applicato a qualsiasi linea iPSC di primati. In questo articolo, descriviamo la produzione di organoidi cerebrali da linee iPSC umane (iLonza2.2)29, scimpanzé (Sandra A)³⁰, macaco rhesus (iRh33.1)²⁹ e uistitì comune (cj_160419_5)³¹. Le condizioni di coltura sono riassunte nella Tabella 1. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature uti....

Discussione

Le procedure qui descritte rappresentano un protocollo unificato per la generazione di organoidi cerebrali da diverse specie di primati con un approccio di elettroporazione mirato. Ciò consente l'espressione ectopica di un GOI in un sistema modello che emula lo sviluppo della neocorteccia (patofisiologica dei primati (incluso l'uomo) (umano). Questo protocollo unificato per la generazione di organoidi cerebrali di primati utilizza gli stessi materiali (ad esempio, media) e fasi di protocollo per tutte e quattro le speci.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305