Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.

Abstract

Le isole pancreatiche di Langerhans, che sono piccole raccolte 3D di cellule endocrine e di supporto specializzate sparse in tutto il pancreas, hanno un ruolo centrale nel controllo dell'omeostasi del glucosio attraverso la secrezione di insulina da parte delle cellule beta, che abbassa la glicemia, e glucagone da parte delle cellule alfa, che aumenta la glicemia. Le vie di segnalazione intracellulare, comprese quelle mediate dal cAMP, sono fondamentali per la secrezione ormonale delle cellule alfa e beta regolata. La struttura delle isole 3D, sebbene essenziale per la funzione coordinata delle isole, presenta sfide sperimentali per gli studi meccanicistici delle vie di segnalazione intracellulare nelle cellule insulari umane primarie. Per superare queste sfide e limitazioni, questo protocollo descrive una piattaforma integrata di imaging per cellule vive e microfluidica che utilizza pseudoisole umane primarie generate da donatori senza diabete che assomigliano alle isole native nella loro morfologia, composizione e funzione. Queste pseudoisole sono di dimensioni controllate attraverso il processo di dispersione e riaggregazione delle cellule insulari umane primarie. Allo stato disperso, l'espressione genica delle cellule insulari può essere manipolata; ad esempio, possono essere introdotti biosensori come il biosensore cAMP geneticamente codificato, cADDis. Una volta formate, le pseudoisole che esprimono un biosensore geneticamente codificato, in combinazione con la microscopia confocale e una piattaforma di microperifusione, consentono la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali delle cellule alfa e beta per fornire maggiori informazioni sui processi e sulla funzione cellulare.

Introduzione

Le isole di Langerhans sono mini organi sparsi in tutto il pancreas la cui funzione è cruciale per il mantenimento dell'omeostasi del glucosio. L'insulina viene secreta dalle cellule beta in seguito al metabolismo del glucosio, all'aumento del rapporto ATP/ADP, alla chiusura dei canali del potassio sensibili all'ATP, alla depolarizzazione della membrana plasmatica e all'afflusso di calcio extracellulare¹. La secrezione di glucagone da parte delle cellule alfa è meno compresa, ma è stato ipotizzato che le vie intracellulari e paracrine contribuiscano all'esocitosi^dei granuli di glucagone ^2,3,4....

Protocollo

Le isole umane (N = 4 preparazioni) sono state ottenute attraverso partnership con il programma di distribuzione integrata delle isole, il programma di analisi del pancreas umano, Prodo Laboratories, Inc. e Imagine Pharma. Il Vanderbilt University Institutional Review Board non considera i campioni pancreatici umani anonimizzati come ricerca su soggetti umani. Questo lavoro non sarebbe possibile senza i donatori di organi, le loro famiglie e le organizzazioni di approvvigionamento di organi. Vedere la Tabella 1 per le informazioni demografiche sui donatori. Le isole umane di donatori di pancreas senza diabete sono state isolate con meno di 15 ore di i....

Discussione

L'integrazione di un sistema di microperifusione, di pseudoisolette che esprimono biosensori e di microscopia confocale a scansione laser consente la valutazione sincrona degli eventi di segnalazione intracellulare e dei profili dinamici della secrezione ormonale. Il sistema dinamico di microperifusione è in grado di fornire una serie di stimoli ben definiti alle pseudoisole e consente la raccolta dell'effluente, in cui le concentrazioni di insulina e glucagone possono essere misurate mediante ELISA disponibile in comme.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component