Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Riepilogo

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Abstract

I modelli tumorali sono fondamentali per i test preclinici dei tumori cerebrali in termini di esplorazione di nuovi trattamenti più efficaci. Con un interesse significativo per l'immunoterapia, è ancora più importante disporre di un modello murino coerente, clinicamente pertinente e immunocompetente per esaminare le popolazioni di cellule tumorali e immunitarie nel cervello e la loro risposta al trattamento. Mentre la maggior parte dei modelli preclinici utilizza il trapianto ortotopico di linee cellulari tumorali consolidate, il sistema di modellazione qui presentato consente una rappresentazione "personalizzata" delle mutazioni tumorali specifiche del paziente in uno sviluppo graduale ma efficace da costrutti di DNA inseriti in cellule precursori neurali (NPC) in divisione in vivo. I costrutti di DNA presentano l'analisi a mosaico con il metodo MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), che consente la mutagenesi somatica a copia singola delle mutazioni driver. Utilizzando cuccioli di topo appena nati tra la nascita e i 3 giorni di età, gli NPC vengono presi di mira sfruttando queste cellule divisorie che rivestono i ventricoli laterali. La microiniezione di plasmidi di DNA (ad esempio, derivati da MADR, trasposoni, sgRNA diretti da CRISPR) nei ventricoli è seguita dall'elettroporazione utilizzando pale che circondano la regione rostrale della testa. Dopo la stimolazione elettrica, il DNA viene assorbito nelle cellule in divisione, con il potenziale di integrarsi nel genoma. L'uso di questo metodo è stato dimostrato con successo nello sviluppo di tumori cerebrali sia pediatrici che adulti, incluso il tumore cerebrale maligno più comune, il glioblastoma. Questo articolo discute e dimostra le diverse fasi dello sviluppo di un modello di tumore cerebrale utilizzando questa tecnica, compresa la procedura di anestesia di giovani cuccioli di topo, alla microiniezione della miscela plasmidico, seguita dall'elettroporazione. Con questo modello murino autoctono e immunocompetente, i ricercatori avranno la possibilità di espandere gli approcci di modellazione preclinica, nel tentativo di migliorare ed esaminare l'efficacia del trattamento del cancro.

Introduzione

I modelli murini di tumore cerebrale sono cruciali per comprendere i meccanismi di formazione e trattamento del tumore cerebrale. I modelli attuali includono tipicamente trapianti sottocutanei o ortotopici prodotti rapidamente di linee cellulari tumorali comunemente usate, sulla base di un numero limitato di mutazioni driver o modelli di xenotrapianto derivati da pazienti, utilizzando topi immunodeficienti che ostacolano i corretti studi di immunoterapia 1,2,3,4. Inoltre, questi risultati preclinici possono portare a falsi positivi, in quant....

Protocollo

Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Cedars Sinai Medical Center (IACUC). I topi omozigoti mTmG sono stati incrociati con topi C57BL/6J per ottenere cucciolate di topi mTmG eterozigoti di sesso misto da utilizzare nel seguente protocollo. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I cuccioli di topo sono stati elettropolizzati tra i giorni postnatali 0 e 3 (P0-P3).

1. Configurazione chirurgica

1. Spruzzare sul tavolo operatorio un disinfettante chimico....

Discussione

La somministrazione di DNA plasmidico basata sull'elettroporazione consente l'uso in vivo della biologia molecolare, simile a quella utilizzata nei modelli murini geneticamente modificati, ma con la velocità, la localizzazione e l'efficienza della trasduzione virale 8,13,14. Con quest'ultimo, tuttavia, arrivano problemi di sicurezza e risposte immunitarie. Abbiamo dimostrato nel nostro sistema di modellizzazione che ut.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH