Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

Riepilogo

Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.

Abstract

Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all'interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall'applicazione di questo protocollo prima del prelievo d'organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.

Introduzione

La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per a....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le regole e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

NOTA: Sebbene il metodo primario di eutanasia descritto sia considerato una tecnica accettabile per l'eutanasia dall'American Veterinary Medical Association¹², non è stato trovato per portare alla cessazione di un battito cardiaco¹³. Anche il metodo secondario frequentemente usato di doppia pithing non impedisce questo, né rimuove il cuore dall'animale. Il dissanguamento di animali anestetizzati è considerato un ....

Discussione

Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.

Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l'efficacia di questa procedura, i risultati pos.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP