Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Riepilogo

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Abstract

I neutrofili sono noti come una delle prime linee di difesa nella risposta immunitaria innata e possono svolgere molte funzioni cellulari particolari, come la chemiotassi, la migrazione inversa, la fagocitosi, la degranulazione di enzimi e metaboliti citotossici e il rilascio di DNA come trappole extracellulari per neutrofili (NET). I neutrofili non solo hanno una segnalazione strettamente regolata, ma partecipano anche alla regolazione di altri componenti del sistema immunitario. Poiché i neutrofili freschi sono terminalmente differenziati, di breve durata e altamente variabili tra gli individui, è importante sfruttare al meglio i campioni raccolti. I ricercatori hanno spesso bisogno di eseguire saggi di screening per valutare una panoramica delle numerose funzioni dei neutrofili che possono essere influenzate da condizioni specifiche in fase di valutazione. Per rispondere a questa esigenza è stata sviluppata una serie di test che seguono un singolo processo di isolamento di neutrofili a densità normale, cercando un equilibrio tra velocità, completezza, costi e precisione. I risultati possono essere utilizzati per ragionare e guidare studi di follow-up approfonditi. Questa procedura può essere eseguita in un tempo medio di 4 ore e include la valutazione della vitalità cellulare, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la migrazione in tempo reale e la fagocitosi del lievito su vetrini, lasciando un numero sufficiente di cellule per approcci più dettagliati come gli studi omici. Inoltre, la procedura include un modo per osservare facilmente un suggerimento preliminare di NET dopo una rapida colorazione panottica osservata dalla microscopia ottica, con una mancanza di marcatori specifici, anche se sufficienti per indicare se ulteriori sforzi in questo modo varrebbero la pena. La diversità delle funzioni testate combina punti comuni tra i test, riducendo i tempi e i costi di analisi. La procedura è stata chiamata NeutroFun Screen e, pur avendo delle limitazioni, bilancia i fattori sopra citati. Inoltre, lo scopo di questo lavoro non è un set di test definito, ma piuttosto una linea guida che può essere facilmente adattata alle risorse e alle esigenze di ciascun laboratorio.

Introduzione

I neutrofili sono le cellule immunitarie innate più abbondanti nel sangue umano e sono noti per svolgere un ruolo importante nelle infezioni e nell'infiammazione, essendo i primi soccorritori ad arrivare al sito^{del danno} tissutale. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente riconoscimento del ruolo cruciale che i neutrofili svolgono in una varietà di malattie e nel sostenere l'omeostasi². I neutrofili non solo hanno una segnalazione strettamente regolata, ma partecipano anche alla regolazione di altri componenti del sistema immunitario ^3,4,5

Protocollo

Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente le linee guida etiche stabilite dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Brasilia (processo 13364819.0.0000.5558) e i campioni sono stati identificati da codici per garantire l'anonimato del donatore. Le cellule sono state ottenute da donatori maschi sani normali di età compresa tra 18 e 35 anni, che hanno firmato il consenso informato e hanno soddisfatto i seguenti criteri di idoneità: non fumatori/vapers, nessuna condizione di salute cronica e nessuna storia di condizioni infiammatorie negli ultimi 14 giorni.

1. Prelievo di sangue

1. Mettere asetti....

Discussione

I neutrofili sono cellule altamente dinamiche e reattive che hanno vita breve e non possono ancora essere crioconservate¹⁹, rendendo difficili le indagini sulla loro biologia. Pertanto, è essenziale seguire attente misure per ottenere neutrofili vitali, arricchiti e a riposo^11,20. Questo studio ha impiegato una tecnica di isolamento basata sulla densità che enfatizza la manipolazione delicata e minima, nonché l'uso di basse temperature .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software