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Data la loro semplice anatomia, i testicoli Anopheles offrono un buon modello citologico per lo studio della spermatogenesi. Questo protocollo descrive l'ibridazione in situ a fluorescenza intera , una tecnica utilizzata per studiare questo processo biologico, nonché il fenotipo di ceppi transgenici che ospitano mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di spermatozoi.
La spermatogenesi è un complesso processo biologico durante il quale le cellule diploidi subiscono una successiva divisione mitotica e meiotica seguita da grandi cambiamenti strutturali per formare spermatozoi aploidi. Oltre all'aspetto biologico, lo studio della spermatogenesi è di fondamentale importanza per la comprensione e lo sviluppo di tecnologie genetiche come il gene drive e le distorsioni sintetiche del rapporto tra i sessi, che, alterando rispettivamente l'ereditarietà mendeliana e il rapporto tra i spermatozoi tra i sessi, potrebbero essere utilizzati per controllare le popolazioni di insetti nocivi. Queste tecnologie si sono dimostrate molto promettenti in laboratorio e potrebbero potenzialmente essere utilizzate per controllare le popolazioni selvatiche di zanzare Anopheles , che sono vettori della malaria. Grazie alla semplicità dell'anatomia del testicolo e alla sua importanza medica, l'Anopheles gambiae, uno dei principali vettori della malaria nell'Africa sub-sahariana, rappresenta un buon modello citologico per lo studio della spermatogenesi. Questo protocollo descrive come l'ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero (WFISH) può essere utilizzata per studiare i drammatici cambiamenti nella struttura nucleare cellulare attraverso la spermatogenesi utilizzando sonde fluorescenti che colorano specificamente i cromosomi X e Y. La FISH di solito richiede la distruzione degli organi riproduttivi per esporre cromosomi mitotici o meiotici e consentire la colorazione di specifiche regioni genomiche con sonde fluorescenti. La WFISH consente di preservare la struttura citologica nativa del testicolo, insieme a un buon livello di rilevamento del segnale da sonde fluorescenti mirate a sequenze di DNA ripetitive. Ciò consente ai ricercatori di seguire i cambiamenti nel comportamento cromosomico delle cellule sottoposte a meiosi lungo la struttura dell'organo, dove ogni fase del processo può essere chiaramente distinta. Questa tecnica potrebbe essere particolarmente utile per studiare l'appaiamento meiotico dei cromosomi e studiare i fenotipi citologici associati, ad esempio, a distorsioni sintetiche del rapporto tra i sessi, sterilità maschile ibrida e knock-out di geni coinvolti nella spermatogenesi.
La malaria impone un enorme onere alla salute e al benessere della popolazione umana mondiale. Nel 2021, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha stimato che la malaria ha causato 619.000 decessi, di cui il 96% si è verificato nell'Africa subsahariana1. La malattia è trasmessa da zanzare appartenenti al genere Anopheles e, nell'Africa subsahariana, tre specie, ovvero Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) e Anopheles arabiensis (An. arabiensis) hanno un ruolo sproporzionatamente grande nella trasmissione della malaria, rappresentando il 95% dei casi di malaria a livello globale. I programmi di controllo basati su metodi tradizionali come insetticidi e farmaci antimalarici hanno salvato milioni di vite; Tuttavia, negli ultimi anni, la crescente resistenza a questi metodi di controllo ne ha messo in discussione l'efficacia 1,2. Inoltre, le restrizioni imposte dalla pandemia di COVID-19 hanno influito sulla disponibilità di interventi chiave per il controllo della malaria, che, secondo il World Malaria Report 2022 dell'OMS, ha aumentato l'incidenza della malaria1. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati nuovi metodi di controllo genetico in laboratorio per colpire le zanzare Anopheles 3,4,5,6,7,8,9,10. Tra queste strategie, quelle basate su sistemi di gene drive (GDS) e distorsioni sintetiche del rapporto tra i sessi (SD) sembrano promettenti. I GDS si basano sulla possibilità di trasmettere, ad altissima frequenza, una modificazione genetica che influisce sulla fertilità femminile o compromette il ciclo vitale del parassita nella zanzara 5,11,12. Le SD, invece, agiscono distorcendo il rapporto tra i sessi della progenie di una zanzara verso i maschi, il che porta, nel tempo, al collasso di una popolazione bersaglio a causa della mancanza di femmine 4,6,13. I componenti principali di questi sistemi genetici agiscono principalmente sugli organi riproduttivi delle zanzare, dove vengono prodotti i gameti, le uova e gli spermatozoi dopo la divisione meiotica14.
In questo protocollo, i progressi nelle tecniche citogenetiche sono impiegati per esplorare la spermatogenesi in An. gambiae, concentrandosi sul comportamento dei cromosomi in situ. La struttura del testicolo della zanzara e i processi biologici che avvengono al suo interno sono stati precedentemente studiati utilizzando una serie di metodi citologici, come l'immunofluorescenza, i transgeni reporter fluorescenti e l'ibridazione in situ a fluorescenza di DNA e RNA (FISH)15,16,17,18,19,20; Gli organi mostrano una forma a fuso, in cui il polo inferiore è attaccato a un condotto deferente collegato alle ghiandole accessorie maschili. Nel polo superiore, la nicchia delle cellule staminali germinali prolifera e si differenzia in cellule spermatogone incorporate all'interno di spermatocisti formate da cellule somatiche. A seguito di più cicli di divisione mitotica, gli spermatogoni si differenziano in spermatociti, che entrano in meiosi. Alla profase, gli autosomi e i cromosomi sessuali si accoppiano con i loro omologhi e avviene il crossing over. Dopo le divisioni meiotiche, vengono generati spermatidi aploidi rotondi che entrano in spermiogenesi, e questo processo porta alla formazione di spermatozoi aploidi maturi in cui il citoplasma è stato rimosso, la cromatina nucleare viene condensata e i flagelli emergono nella parte basale dei nuclei21,22 (Figura 1 e Figura 2).
In generale, la spermiogenesi inizia intorno allo stadio intermedio della pupa e gli spermatozoi maturi possono essere rilevati nella fase tardiva della pupa nel serbatoio spermatico23. Il processo di maturazione delle spermatocisti continua durante la vita adulta23,24,25. Nei testicoli di Anopheles, ogni fase della spermatogenesi può essere facilmente identificata osservando la morfologia nucleare delle cellule in ciascuna spermatocisti (Figura 2). L'ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero (WFISH), descritta in questo protocollo, consente ai ricercatori di etichettare in modo specifico una regione cromosomica e di seguirla durante la spermatogenesi, preservando la struttura nativa dell'organo e la posizione dei nuclei cellulari; questo rappresenta un vantaggio rispetto al protocollo standard DNA FISH in cui l'organo viene solitamente schiacciato, portando a danni tissutali19. Nel protocollo attuale, le sonde fluorescenti vengono utilizzate per colorare le sequenze ripetitive sui cromosomi sessuali e, quindi, tracciare il loro comportamento durante la spermatogenesi, dalle cellule diploidi che si dividono agli spermatozoi aploidi maturi. La WFISH può essere particolarmente utile per studiare l'appaiamento meiotico dei cromosomi sessuali e studiare i fenotipi citologici associati, ad esempio, a distorsioni sintetiche del rapporto tra i sessi, sterilità maschile ibrida e knock-out dei geni coinvolti nella spermatogenesi 4,19,26,27.
Dato il loro ruolo di vettori della malaria, le zanzare Anopheles sono il bersaglio di un numero crescente di strategie di controllo dei vettori genetici, che spesso agiscono negli organi riproduttivi di questi organismi. Sono stati generati diversi mutanti di zanzare e fenotipi citologici che richiedono nuove tecniche citologiche per essere studiati26,27,28,29. Il metodo descritto in questo studio fa luce sulla comprensione della spermatogenesi, nonché sui meccanismi citologici alla base delle strategie genetiche che hanno il potenziale per controllare le zanzare che trasmettono la malaria.
1. Etichettatura della sonda del DNA
NOTA: Di seguito sono riportati i passaggi tecnici per generare sonde di DNA fluorescenti che etichettano specificamente i cromosomi sessuali delle zanzare An. gambiae.
2. Preparazione della soluzione di ibridazione
NOTA: Le sonde fluorescenti generate nella fase 1 devono essere incorporate in una soluzione chimica che si ibrida con le sequenze target.
3. Dissezione e fissazione del testicolo
4. Ibridazione
NOTA: Questa sezione descrive le fasi finali per l'ibridazione in situ .
In questo lavoro, WFISH è stato utilizzato per studiare il comportamento cromosomico durante la spermatogenesi in An. gambiae. Il primo passo fondamentale per l'applicazione di questo protocollo è l'ottenimento di testicoli che mostrino un basso livello di alterazione morfologica dopo la dissezione. Per eseguire con successo una dissezione testicolare è necessaria una conoscenza di base dell'anatomia della zanzara e, di seguito, vengono fornite alcune indicazioni per questa procedura. Nella zanzara Anopheles , i testicoli maturi si trovano nel sesto segmento addominale degli stadi pupa e adulto21. Come mostrato nella Figura 1, il dotto deferente collega i testicoli alle ghiandole accessorie maschili (MAG), che si trovano nell'ultimo segmento dell'addome. Le MAG sono collegate a un dotto eiaculatorio unico che trasporta gli spermatozoi e i liquidi seminali all'organo copulatore e alla parte esterna dell'apparato genitale maschile21. L'intero apparato genitale maschile interno può essere sezionato utilizzando diversi approcci a seconda dello stadio di vita della zanzara. Durante la fase pupale, i testicoli possono essere facilmente identificati utilizzando uno stereomicroscopio in tutta la cuticola leggera osservando il lato ventrale dell'addome in prossimità del sesto segmento (Figura 1). Per sezionare i testicoli, la parte inferiore dell'addome, compreso il sesto segmento, può essere isolata dal resto del corpo utilizzando un paio di aghi e trasferita in una goccia pulita di PBS 1x. Dopo la rimozione dell'ultimo segmento, l'intero apparecchio può essere schiacciato dall'addome applicando una leggera pressione con gli aghi da dissezione. Per sezionare i testicoli dai maschi adulti, il primo passo consiste nell'isolare l'intero addome in una nuova goccia di PBS 1x e poi estrarre l'ultimo segmento che porta i fermagli, che sono le strutture copulatorie maschili (Figura 1). A questo punto, la parte inferiore dei MAG dovrebbe emergere ed essere facilmente identificabile grazie al loro colore giallo. L'intero apparato maschile può quindi essere estratto lentamente con l'aiuto di un ago o di una pinza in una goccia di 1x PBS fino a quando la coppia di testicoli attaccati al dotto deferente non è visibile. Prima di procedere con la fissazione, è importante isolare i testicoli dalle altre parti dell'apparato maschile tagliando in prossimità della parte inferiore dei dotti deferenti (Figura 1).
L'età delle pupe o dei maschi adulti è un fattore importante da considerare a seconda dello stadio di spermatogenesi in esame. In An. gambiae, la spermatogenesi inizia allo stadio iniziale/medio pupale e continua per tutta la vita dell'individuo24. Tra le 3 e le 10 ore dopo l'impupamento, gli stadi premeiotico e meiotico sono più rappresentati nel testicolo (profase meiotica, divisioni meiotiche), il DNA degli spermatidi è relativamente non condensato e gli spermatozoi maturi non si sono ancora formati. Le pupe tardive e gli adulti di 1 giorno di età offrono un buon equilibrio tra gli stadi premeiotico, meiotico e post-meiotico (Figura 2 e Figura 3). Negli adulti che hanno più di 4 giorni di vita, gli stadi premeiotici e le spermatocisti sono meno rappresentati e i testicoli sono occupati principalmente da spermatozoi maturi contenuti nel serbatoio spermatico.
Per studiare il comportamento dei cromosomi sessuali durante le diverse fasi della spermatogenesi, la WFISH è stata eseguita su testicoli sezionati allo stadio di pupa tardiva per garantire una buona rappresentazione dell'intero processo. Per seguire il comportamento di questi cromosomi, sono state utilizzate sonde fluorescenti specifiche per sequenze ripetitive situate esclusivamente sul cromosoma X o Y. Le sonde fluorescenti possono essere generate utilizzando la PCR o ottenute commercialmente come oligonucleotidi marcati con estremità 3'. Si consiglia l'utilizzo di un oligo con una lunghezza di >40 bps per consentire un buon rilevamento del segnale dalla sonda fluorescente per oligo. In base alla nostra esperienza, gli oligo marcati con estremità 3' hanno prestazioni migliori rispetto alle sonde marcate con PCR in termini di rilevamento del segnale. Inoltre, il numero di copie della sequenza target è un fattore che può influenzare l'efficacia della WFISH. Se la marcatura non ha successo, si suggerisce di utilizzare il metodo di marcatura PCR su un frammento più lungo o di progettare diversi oligo specifici per la regione bersaglio.
I metodi attuali, basati sull'utilizzo di una soluzione penetrante (1% Tritone/0,1 M HCl in 1x PBST), consentono un buon livello di permeabilizzazione testicolare e penetrazione delle sonde, con conseguente reazione di ibridazione di successo. Le sonde oligo specifiche per le sequenze ripetitive dei cromosomi sessuali possono essere progettate sulla base dell'ampia caratterizzazione degli elementi ripetitivi eseguita da Hall et al.20. Inoltre, le sequenze di consenso specifiche per gli elementi ripetitivi legati all'X o all'Y possono essere ottenute utilizzando una piattaforma bioinformatica come la pipeline RedKmer30. È importante notare che le sonde dei cromosomi sessuali possono colpire elementi ripetitivi come satelliti e retrotrasposoni, e possono avere un diverso livello di ibridazione con i cromosomi X o Y a seconda della specie in esame 20,31,32. Come mostrato in Figura 3, un buon livello di ibridazione delle sonde e un basso background hanno permesso la visualizzazione dei cromosomi bersaglio durante la spermatogenesi. L'appaiamento dei cromosomi sessuali marcati potrebbe essere visto nelle fasi premeiotica e meiotica. Questo è stato seguito dal rilevamento dei cromosomi X o Y nei nuclei delle cellule aploidi, cromosomi risultanti da divisioni meiotiche. Successivamente, gli spermatidi portatori di X o Y potrebbero essere seguiti durante la spermiogenesi, caratterizzata da diversi livelli di condensazione del DNA, fino alla fase finale degli spermatozoi maturi a forma di freccia. Nell'attuale configurazione sperimentale, sono state utilizzate Z-stack confocali per acquisire informazioni riguardanti l'organizzazione spaziale 3D delle cellule durante questo processo (Video 1).
Figura 1: Testicoli sezionati da pupe e maschi adulti di Anopheles gambiae di 1 giorno. (A) Un addome sezionato alla fase tarda della pupa che mostra la posizione dei testicoli in prossimità del sesto segmento addominale. I testicoli possono essere identificati in tutta la cuticola e appaiono come strutture brunastre su entrambi i lati dell'addome (con frecce). (B) Testicoli sezionati allo stadio di pupa, mostrando i testicoli maturi (1), i dotti deferenti (2), i MAG (3) e il dotto eiaculatorio (4). (C) Un addome sezionato da un maschio adulto di 1 giorno dopo aver rimosso il segmento basale della fibbia. I MAG possono essere schiacciati dall'addome applicando una leggera pressione (freccia bianca). (D) Apparato riproduttivo interno maschile sezionato da un maschio adulto di 1 giorno. La freccia bianca indica la posizione occupata dagli spermatozoi maturi, che appaiono come un aggregato bianco al polo basale del testicolo. Barre di scala: (A,C) 200 μm; (B,D) 100 μm. I numeri romani da I a VIII indicano i segmenti addominali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione della spermatogenesi in Anopheles gambiae. L'immagine a sinistra mostra un testicolo tardivo della pupa di An. gambiae dopo la colorazione DAPI a montaggio intero. A destra c'è una versione schematica per una migliore visualizzazione. Osservando la forma nucleare e il livello di condensazione, è relativamente facile seguire tutte le fasi della spermatogenesi dalle cellule diploidi agli spermatozoi aploidi. La nicchia delle cellule staminali è situata nel polo superiore dell'organo, dove inizia la differenziazione in spermatogoni. Le cellule spermatogone aumentano di numero dopo la divisione mitotica (cellule verdi) e le spermatocisti aumentano di dimensioni (cellule gialle). Le cellule degli spermatogoni si differenziano in spermatociti dopo più cicli di divisioni mitotiche (cellule blu). Gli spermatociti, che sono caratterizzati da nuclei relativamente più grandi rispetto alle cellule delle altre fasi del processo, sono le cellule che subiranno la divisione meiotica. Le cellule sottoposte a meiosi possono essere rilevate osservando la presenza di cromosomi in diversi stadi meiotici; I chiasmi e i cromosomi in metafase possono essere rilevati anche a basso ingrandimento. Gli stadi premeiotici sono sovrarappresentati nei testicoli sezionati allo stadio iniziale di pupa. Dopo la prima e la seconda divisione meiotica, vengono prodotti gli spermatidi che di solito si trovano al centro del testicolo. I nuclei degli spermatidi mostrano un certo grado di variazione nella loro forma, da una forma rotonda a una forma a freccia. Gli spermatidi entrano nel processo di spermiogenesi, durante il quale i nuclei iniziano a condensarsi e la loro struttura cambia in punti simili a frecce. Quando le zanzare maturano sessualmente dopo essere emerse, le spermatocisti contenenti spermatozoi maturi possono occupare la maggior parte del volume del testicolo a spese delle spermatocisti in un diverso stadio di sviluppo. Barra graduata: 20 μm. L'asterisco (*) indica la parte apicale del testicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: WFISH su un testicolo di An. gambiae sezionato a partire dalla fase tardiva di pupa. La WFISH è stata eseguita utilizzando sonde specifiche per i cromosomi X (Contig_240) e Y (sonda oligo specifica per AgY53B). (A) WFISH permette di seguire il comportamento del cromosoma sessuale durante la spermatogenesi da cellule diploidi a spermatozoi aploidi. In questa immagine è possibile apprezzare i drammatici cambiamenti che i nuclei subiscono durante la spermatogenesi. L'etichettatura dei cromosomi sessuali consente la discriminazione tra cellule diploidi e aploidi. Nelle cellule diploidi, il segnale proveniente dai cromosomi sessuali è legato agli stessi nuclei. Nelle cellule aploidi (spermatidi e spermatozoi), il segnale dei cromosomi sessuali è scollegato a causa della divisione meiotica riduttiva. (B,C) Un'immagine con un ingrandimento maggiore (63x) del testicolo è mostrata in (A). Sono stati acquisiti in diverse posizioni lungo l'asse Z. Le cornici bianche punteggiate indicano l'area di acquisizione. (B) La fase di transizione tra spermatociti e spermatidi, che mostra la formazione di cellule aploidi e la separazione dei segnali dai cromosomi sessuali in nuclei separati. (C) La fase di transizione tra spermatidi aploidi e spermatozoi maturi. Questa fase mostra le variazioni del livello di condensazione nucleare; Gli spermatozoi maturi mostrano una forma più condensata e allungata rispetto agli spermatidi. Barre graduate: (A), 30 μm; (B,C), 10 μm; Grigio: DAPI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Sequenza di destinazione | Sequenza del primer e consenso dell'oligo-sonda | Riferimento |
Contig_240 (X) | 5'-CAATAAATTTCCTTTTTTTTTGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorocromo] | 19 |
AgY53B (Y) | 5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorocromo] | Questo studio |
AgY477- AgY53B giunzione regione (Y) | 5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorocromo] | 19 |
18S rDNA (X) | F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA | 19 |
AgY53B (Y) | F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG | 19 |
Tabella 1: Elenco delle sonde oligo specifiche per il cromosoma X o Y in An. gambiae.
Video 1: Una pila 3D su WFISH eseguita su un testicolo di An. gambiae sezionato dallo stadio tardivo di pupa. Per ottenere una rappresentazione 3D del processo di spermatogenesi, è possibile eseguire una pila 3D confocale su testicoli che presentano un basso numero di alterazioni strutturali. In questo studio, le pile sono state eseguite con un intervallo di 1,25 μm tra due sezioni ottiche sotto una lente a olio 63x o 40x per non perdere informazioni sull'organizzazione spaziale 3D delle cellule. Grigio: DAPI, giallo: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Clicca qui per scaricare questo video.
Comunemente, i protocolli FISH richiedono lo schiacciamento dell'organo di interesse per consentire la colorazione cromosomica. Ciò provoca una perdita di informazioni sulla disposizione spaziale delle cellule all'interno di quell'organo33. Questo protocollo descrive come i processi biologici, come la spermatogenesi, possono essere studiati in situ mantenendo intatta la struttura nativa del testicolo e la sua organizzazione citologica interna. Le sonde che hanno come bersaglio diversi elementi ripetitivi del DNA, che sono particolarmente arricchiti nei cromosomi sessuali20, possono essere utilizzate simultaneamente per rivelare la dinamica della maturazione degli spermatozoi. A seconda dei tempi della dissezione testicolare, WFISH offre l'opportunità di studiare diversi stadi della spermatogenesi attraverso lo sviluppo delle zanzare. La WFISH è utile per lo studio di fenomeni specifici come l'incompatibilità ibrida, che, nelle zanzare Anopheles, è dovuta alla presenza di difetti meiotici come il fallimento premeiotico e la non disgiunzione dei cromosomi sessuali 19,34,35. Oltre all'aspetto biologico, la spermatogenesi è l'obiettivo di una serie di strategie genetiche sviluppate per controllare gli insetti nocivi come le zanzare Anopheles. In questo contesto, il locus dell'rDNA legato all'X di An. gambiae è stato utilizzato come bersaglio per sviluppare un distorcente sintetico del rapporto tra i sessi, che, danneggiando gli spermatozoi portatori di X, orienta la progenie verso i maschi 4,8,13.
Questa tecnologia rispecchia l'azione delle pulsioni meiotiche naturali del rapporto tra i sessi che sono state identificate in diversi taxa, tra cui le zanzare, ma che rimangono ancora poco comprese 28,36,37,38,39,40,41. WFISH offre l'opportunità di studiare questo fenomeno e apre la strada al perfezionamento o al miglioramento delle strategie genetiche basate sulla distorsione sessuale, ad esempio fornendo informazioni su come la citologia della produzione di spermatozoi sia influenzata dalla scelta dei siti bersaglio utilizzati per la triturazione dei cromosomi sessuali. Sebbene, secondo la nostra esperienza, il WFISH mostri alte probabilità di successo, il fallimento può ancora verificarsi. Ciò potrebbe essere dovuto a un livello inefficiente di permeabilizzazione tissutale, che può essere superato aumentando il tempo di incubazione della soluzione penetrante. In alternativa, la proteinasi K può essere utilizzata durante la fase di permeabilizzazione. In alcuni casi, abbiamo notato un livello non uniforme di penetrazione della sonda, con un segnale più alto nei nuclei degli spermatociti e un segnale più basso o assente nelle fasi meiotiche e di spermiogenesi. Ciò potrebbe essere dovuto a una differenza nel livello di permeabilizzazione a seconda dello stadio cellulare. Inoltre, WFISH si è dimostrato prezioso quando si utilizzano sonde fluorescenti progettate per colpire sequenze di DNA presenti in un numero elevato di copie. Quando si prendono di mira geni a singola copia, il rilevamento del segnale potrebbe non essere sufficiente. In questo caso, devono essere integrati metodi per l'amplificazione del segnale, come l'amplificazione del segnale della tiramide (TSA)42.
Questo protocollo potrebbe essere accoppiato con l'immunocolorazione o con ceppi reporter transgenici che ospitano marcatori fluorescenti specifici per la linea germinale16,18, in quanto ciò aggiungerebbe informazioni sulla localizzazione delle proteine e sull'espressione genica in situ. In questo lavoro, il WFISH è descritto come una tecnica per studiare la spermatogenesi nelle zanzare Anopheles; Tuttavia, data l'anatomia condivisa degli organi riproduttivi maschili, questo protocollo potrebbe essere applicato ad altre specie di zanzare che svolgono un ruolo nella trasmissione della malattia. Allo stesso modo, la gametogenesi femminile potrebbe essere studiata utilizzando questa tecnica. Inoltre, potrebbero essere esplorati studi citologici in organi o tessuti di interesse, come l'intestino medio della zanzara, che è un bersaglio per l'invasione del parassita, o background genetici atipici, come quelli nelle zanzare ibride43. Inoltre, questa tecnica può essere potenzialmente trasferita ad altri organismi all'interno dell'ordine dei Ditteri.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Bill & Melinda Gates Foundation e di Open Philanthropy. Si ringrazia la Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) dell'Imperial College di Londra per l'analisi microscopica. La Figura 2 è stata creata con Biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
Primer sequences | |||
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] | Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] | Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] | Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) | |
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA | Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG | Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |
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