Modello di metastasi linfonodali drenanti per la valutazione della dinamica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante la tumorigenesi

Riepilogo

Il disegno sperimentale qui presentato fornisce un utile modello riproduttivo per gli studi delle cellule T CD8⁺ antigene-specifiche durante le metastasi linfonodali (LN), che esclude la perturbazione delle cellule T CD8⁺ astanti.

Abstract

Le cellule T CD8⁺ specifiche dell'antigene tumorale provenienti dai linfonodi drenanti acquisiscono un'importanza crescente nel montare la risposta immunitaria antitumorale durante la tumorigenesi. Tuttavia, in molti casi, le cellule tumorali formano loci metastatici nei linfonodi prima di metastatizzare ulteriormente in organi distanti. Fino a che punto le risposte locali e sistematiche delle cellule T CD8⁺ siano state influenzate dalle metastasi dei LN rimane oscuro. A tal fine, abbiamo messo a punto un modello murino di metastasi LN combinato con una linea cellulare di melanoma B16F10-GP che esprime il neoantigene surrogato derivato dal virus della coriomeningite linfocitaria (LCMV), dalla glicoproteina (GP) e da topi transgenici P14 che ospitano recettori delle cellule T (TCR) specifici per il peptide GP_33-41 derivato da GP presentato dalla molecola del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I H-2D^b. Questo protocollo consente lo studio delle risposte antigene-specifiche delle cellule T CD8⁺ durante le metastasi dei LN. In questo protocollo, i topi C57BL/6J sono stati impiantati per via sottocutanea con cellule B16F10-GP, seguite da trasferimento adottivo con cellule P14 naive. Quando il tumore sottocutaneo è cresciuto fino a circa 5 mm di diametro, il tumore primario è stato asportato e le cellule B16F10-GP sono state iniettate direttamente nel linfonodo drenante del tumore (TdLN). Successivamente, la dinamica delle cellule T CD8⁺ è stata monitorata durante il processo di metastasi dei LN. Collettivamente, questo modello ha fornito un approccio per studiare con precisione le risposte immunitarie delle cellule T CD8⁺ specifiche dell'antigene durante le metastasi dei LN.

Introduzione

L'immunoterapia del cancro, in particolare il blocco del checkpoint immunitario (ICB), ha rivoluzionato la terapia del cancro¹. L'ICB blocca gli immunorecettori coinibitori (come PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), che sono altamente espressi nelle cellule T CD8⁺ esauste nel microambiente tumorale (TME), portando al rinvigorimento delle cellule T CD8⁺ esauste². Considerando l'eterogeneità delle cellule T CD8⁺ esaurite, l'accumulo di prove ha rivelato che le cellule T CD8⁺ specifiche del tumore derivate dalla periferia, incluso il linfonodo drenante (dLN), ma non nella TME, mediano l'e....

Protocollo

I topi C57BL/6J (riferiti ai topi B6) e i topi transgenici naïve P14 ^9,27 utilizzati avevano un'età compresa tra 6 e 10 settimane e un peso di 18-22 g. Sia i maschi che le femmine sono stati inclusi senza randomizzazione o accecamento. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Agraria di Qingdao.

1. Preparazione del terreno e dei reagenti

1. Preparare il terreno di coltura cellulare di melanoma B16F10-GP, denominato D10 (terreno DMEM completo)....

Discussione

Durante la tumorigenesi, le cellule presentanti l'antigene (APC) inghiottono gli antigeni tumorali e migrano verso TdLN dove innescano le cellule T CD8⁺. Dopo l'innesco e l'attivazione, le cellule T CD8⁺ lasciano il TdLN e si infiltrano nel tumore per uccidere le cellule tumorali¹⁰. Attraverso la resezione di TdLN e la somministrazione di FTY720 che bloccano l'uscita delle cellule immunitarie dagli organi linfoidi, diversi studi hanno dimostrato il ruolo fondamentale di TdLN .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml