Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l'imaging del calcio ex vivo , consentendo l'esplorazione dei potenziali meccanismi dell'epilessia a livello cellulare.

Abstract

L'epilessia è un disturbo neurologico caratterizzato da convulsioni ricorrenti, parzialmente correlate all'origine genetica, che colpisce oltre 70 milioni di individui in tutto il mondo. Nonostante l'importanza clinica dell'epilessia, l'analisi funzionale dell'attività neurale nel sistema nervoso centrale deve ancora essere sviluppata. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, in combinazione con l'espressione stabile di indicatori di calcio geneticamente codificati, come GCaMP6, hanno rivoluzionato lo studio dell'epilessia sia a livello cerebrale che a livello di risoluzione di una singola cellula. La Drosophila melanogaster è emersa come strumento per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dell'epilessia grazie alla sua sofisticata genetica molecolare e ai suoi saggi comportamentali. In questo studio, presentiamo un nuovo ed efficiente protocollo per l'imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. L'intero cervello viene preparato da cac, un noto gene dell'epilessia, moscerini knockdown per l'imaging del calcio con un microscopio confocale per identificare l'attività neurale come follow-up del test comportamentale simile a un attacco sensibile al bang. Le mosche knockdown del CAC hanno mostrato un tasso più elevato di comportamento simile a convulsioni e attività anomale del calcio, tra cui picchi più grandi e meno picchi piccoli rispetto ai moscerini wild-type. Le attività del calcio sono state correlate a un comportamento simile a quello delle convulsioni. Questa metodologia funge da metodologia efficiente per lo screening dei geni patogeni per l'epilessia e per l'esplorazione del potenziale meccanismo dell'epilessia a livello cellulare.

Introduzione

L'epilessia, una complessa malattia neurologica cronica caratterizzata dalla ricorrenza di convulsioni spontanee e non provocate e da un'attività aberrante della rete neuronale, ha colpito oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo, rendendola una^{delle malattie} neurologiche più comuni e portando ai pesanti fardelli delle famiglie e della società. In considerazione dell'impatto dell'epilessia, sono stati condotti molti studi per identificare l'eziologia delle convulsioni, di cui la genetica è stata approvata come causa primaria di molti tipi di epilessie o sindromi epilettiche². Negli ultimi decenni, i progressi nelle ....

Protocollo

1. Protocollo per il saggio sensibile al bang

1. Stabilire le mosche sperimentali incrociando la linea driver tub-Gal4 con la linea UAS-cac-RNAi tramite il sistema Gal4/UAS²¹. Raccogli le mosche vergini della linea tub-Gal4 e le mosche maschi della linea UAS-cac-RNAi . Quindi, trasferisci le mosche vergini e maschili nella stessa fiala per raccogliere la prole.
   NOTA: La linea di driver tub-Gal4 consentirà di ottenere il knockdown globale del gene cac . Utilizzare la linea UAS-cac-RNAi come gruppo di controllo.
2. Dopo 3-5 giorni dall'eclusione, anes....

Discussione

Lo ione calcio funge da secondo messaggero cruciale, svolgendo un ruolo fondamentale in una serie di risposte fisiologiche e fisiopatologiche a perturbazioni sia chimiche che elettriche. Inoltre, l'elemento topologico dei canali P/Q presinaptici, codificato dal gene CACNA1A umano, è stato identificato come responsabile della mediazione della scarica di vari neurotrasmettitori, tra cui il glutammato 30,31,32, ed è strettamente legato all'epilessia ^.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background