La combinazione di frazione vascolare stromale isolata meccanicamente e idrogel di fibrina: un protocollo di elaborazione

Riepilogo

La frazione vascolare stromale (SVF) isolata meccanicamente in combinazione con un idrogel di fibrina offre un vettore facile ed efficiente per cellule stromali vitali di derivazione adiposa per varie indicazioni, tra cui l'ingegneria tissutale e/o la guarigione delle ferite. Qui, presentiamo la preparazione di un costrutto meccanico di SVF (mSVF)-fibrina idrogel per la ricerca traslazionale e l'applicazione clinica.

Abstract

Il potenziale rigenerativo delle cellule stromali di derivazione adiposa (ASC) ha guadagnato un'attenzione significativa nella ricerca rigenerativa e traslazionale. In passato, l'estrazione di queste cellule dal tessuto adiposo richiedeva un processo enzimatico a più fasi, che risultava in un mix di cellule eterogenee costituito da ACS e altre cellule, che sono congiuntamente chiamate frazione vascolare stromale (SVF). I protocolli di isolamento SVF meccanico (mSVF) introdotti più di recente richiedono meno tempo e aggirano i problemi normativi. Recentemente abbiamo proposto un protocollo che genera mSVF ricca di cellule stromali basata su una combinazione di emulsione e centrifugazione. Un problema attuale nell'applicazione della mSVF per l'applicazione della terapia delle ferite è la mancanza di un'impalcatura che fornisca protezione dalla manipolazione meccanica e dall'essiccazione. In passato, gli idrogel di fibrina hanno dimostrato di essere un utile coadiuvante nel trasferimento cellulare per scopi di guarigione delle ferite. Nel lavoro qui presentato, delineiamo le fasi di preparazione di un costrutto di idrogel di fibrina mSVF come un nuovo approccio per la ricerca traslazionale e l'applicazione clinica.

Introduzione

Negli ultimi anni, la chirurgia plastica rigenerativa è emersa come un ulteriore pilastro della chirurgia plastica¹. La chirurgia plastica rigenerativa mira a ripristinare il tessuto danneggiato trasferendo fattori solubili, cellule e tessuti raccolti dal paziente per promuovere il ripristino dei tessuti in modo minimamente invasivo². Le cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) hanno attirato l'attenzione grazie alla loro capacità di differenziarsi in più linee mesenchimali, rendendole un candidato promettente per la ricerca sulla medicina rigenerativa³. Il loro profilo citochinico mostra effetti angiogenici, immunosoppressivi e antiossidanti⁴.

Tradizionalmente, le ASC sono state isolate dal tessuto adiposo utilizzando un approccio enzimatico con collagenasi, ottenendo una frazione vascolare stromale (SVF), che è stata successivamente coltivata per ottenere ASC. Queste tecnologie di laboratorio sono costose, richiedono molto tempo e, soprattutto, sono soggette a rigide restrizioni normative, complicando la traduzione clinica ^5,6,7. Al contrario, i protocolli di frazione vascolare stromale isolata meccanicamente (mSVF) offrono i vantaggi clinici non solo di aggirare i problemi normativi, ma anche di ridurre al minimo i rischi di contaminazione ^8,9.

Sono stati descritti numerosi protocolli per isolare meccanicamente la SVF¹⁰. Tra questi, il protocollo di spostamento pubblicato da Tonnard et al. ha guadagnato la massima attenzione tra i chirurghi rigenerativi¹¹. Il grasso raccolto attraverso le procedure standard di liposuzione, note come lipoaspirati, può essere trasferito tra due siringhe portatili collegate a un dispositivo di collegamento, ottenendo una forma liquida denominata nanograsso. Gli ovvi vantaggi di questi protocolli di isolamento della mSVF includono tempi di elaborazione ridotti, rischio minimo di contaminazione, poiché l'intera procedura viene eseguita in un ambiente ben controllato, e la possibilità di traduzione clinica immediata¹².

L'evidenza preclinica e clinica indica che le proprietà della mSVF, tra cui la vitalità cellulare e le proprietà di guarigione delle ferite, sono paragonabili ai metodi standard di isolamento enzimatico¹². Il potenziale della mSVF nel promuovere la guarigione delle ferite in modelli di ratto e murini è stato convalidato attraverso studi in vivo di Chen et al. e Sun et al.13,14. Tuttavia, mancano dati disponibili sulla guarigione delle ferite in ambito clinico. Risultati promettenti sono stati riportati quando un gruppo di studio ha eseguito un trapianto di grasso autologo in un paziente di 83 anni che aveva una ferita con un impianto esposto in una frattura aperta dell'arto inferiore¹⁵. Inoltre, Lu et al. hanno condotto un confronto tra mSVF e terapia delle ferite a pressione negativa in una coorte di 20 pazienti con ferite croniche¹⁶. I loro risultati hanno rivelato che il trattamento con mSVF ha portato a un tasso più elevato di guarigione delle ferite rispetto alla terapia delle ferite a pressione negativa¹⁶. Entrambi gli studi citati hanno iniettato mSVF da sola o in combinazione con un gel nell'area della ferita mirata^15,16.

Nello scenario del mondo reale, l'applicazione clinica della mSVF è limitata a causa dei tassi di assorbimento imprevedibili nei siti riceventi^17,18. Gli scaffold promettono un rimedio a questo problema, in quanto aiutano nella ritenzione cellulare, nella vascolarizzazione e nell'integrazione nel tessuto circostante 19,20,21. Gli idrogel di fibrina sono uno strumento comunemente usato, approvato dalla FDA, utilizzato nelle discipline chirurgiche e hanno dimostrato di essere un efficace vettore di mSVF¹⁹. Il gel di fibrina è un materiale biopolimerico che offre diversi vantaggi nel funzionare come vettore cellulare: mostra un'eccellente biocompatibilità, favorisce l'adesione cellulare ed è in grado di degradarsi in modo controllabile 22,24,25. Inoltre, dimostra una reazione infiammatoria e da corpo estraneo minima ed è facilmente assorbito durante il corso naturale della guarigione delle ferite²². Riteniamo che le diverse capacità rigenerative delle cellule mSVF menzionate e la vantaggiosa combinazione con un idrogel di fibrina possano fornire un approccio innovativo per migliorare i processi di guarigione delle ferite. Nel complesso, questo approccio consente un'efficiente somministrazione topica di cellule mSVF vitali. Con la presente presentiamo il protocollo che combina mSVF con un idrogel di fibrina destinato all'applicazione a scopo di guarigione delle ferite.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti i donatori adulti hanno fornito il consenso informato scritto per consentire l'ulteriore utilizzo dei campioni di tessuto raccolti. Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana della nostra istituzione.

1. Raccolta del tessuto adiposo

1. Prelevare il tessuto adiposo eseguendo una liposuzione standard in una tecnica convenzionale di raccolta del grasso descritta in precedenti pubblicazioni^26,27. Assicurati di utilizzare una soluzione tumescente composta da lattato di Ringer normale ed epinefrina in un rapporto di 1: 200.000.
2. Eseguire la liposuzione con una cannula di aspirazione da 4 mm, a pressione negativa e vibrazione, in una sacca sterile. Trasferire immediatamente il grasso raccolto in laboratorio.

2. Isolamento mSVF

1. Eseguire i seguenti passaggi (sezioni 2 e 3) in una cappa di coltura cellulare per ottenere un'area di lavoro asettica. Indossare un camice da laboratorio regolare e guanti per garantire il livello di sicurezza biologica 2.
2. Preparare il terreno di coltura: Integrare 500 ml di Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio con 50 ml di siero fetale bovino (FBS), 5 ml di penicillina-streptomicina.
3. Trasferire il lipoaspirato in una provetta da centrifuga da 50 ml.
4. Trasferire il lipoaspirato in una siringa Luer-lock sterile da 20 ml e collegare un connettore da 1,4 mm. Assicurarsi che non ci sia aria all'interno della siringa.
5. Collegare una seconda siringa Luer-lock da 20 ml al lato controlaterale del connettore da 1,4 mm.
6. Spingere il tessuto adiposo da una siringa all'altra per un totale di 30 volte.
7. Trasferire il grasso emulsionato in una provetta da centrifuga fresca da 50 ml.
8. Centrifugare il grasso emulsionato a 500 x g per 10 min.
9. Dopo la centrifugazione, scartare lo strato superiore oleoso. Quindi, raccogliere lo strato centrale di mSV purificato. Trasferirlo in una provetta da centrifuga fresca da 50 ml ed eliminare la fase acquosa.
10. Riempire la provetta da centrifuga con terreno di coltura (dal passaggio 2.2) fino alla tacca di 40 ml.
11. Inserire la provetta da centrifuga nella centrifuga e centrifugare nuovamente a 500 x g per 5 minuti.
12. Raccogliere lo strato mSVF risultante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.

3. Produzione di idrogel di mSVF-fibrina

1. Combinare 100 μL di mSVF con 10 μL di trombina (100 U/mL), 10 μL di CaCl₂ (80 mM) e 70 μL di acido tranexamico (100 mg/mL) in una provetta sterile da 1,5 mL.
2. Utilizzare un puntale per pipetta nuovo per aggiungere 10 μL di fibrinogeno (100 mg/mL) come ultimo componente, poco prima dell'applicazione. Attenzione che la polimerizzazione dell'idrogel si osserva entro circa 10-30 s.
3. Per l'applicazione clinica, eseguire quest'ultimo passaggio poco prima della somministrazione topica, preferibilmente al letto del paziente. Per scopi analitici, trasferire in una piastra a 12 pozzetti mediante pipettaggio.

4. Saggio di vitalità e istologia

1. Pipettare 200 μl della miscela mSVF-idrogel della fase 3.3 in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
2. Pipettare 100 μl della raccolta mSVF (passaggio 2.12.) in un pozzetto come controllo positivo.
3. Pipettare 200 μL di idrogel di fibrina in un solo pozzetto come controllo negativo.
4. Posizionare la piastra a 12 pozzetti in un normale incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per 30 minuti.
5. Trascorso questo tempo, aggiungere 1 mL di resazurina (alamar blue, concentrazione del 10%, diluito in terreno di coltura) a ciascun pozzetto.
6. Dopo l'aggiunta, incubare la piastra a 12 pozzetti a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.
7. Dopo 24 ore, misurare la prima intensità di fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre multimodale per imaging cellulare utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 555 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 596 nm.
8. Esegui misurazioni consecutive dell'intensità della fluorescenza nei giorni 3 e 7.
9. Se è necessaria una valutazione istologica, interrompere l'esperimento nei giorni 1, 3 e 7 e fissare l'idrogel di fibrina in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 ore. Dopo il fissaggio, aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato all'1% (PBS) e conservarla a 4 °C.
10. Incorporare gli idrogel in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e sezionare i blocchi congelati a uno spessore di 10 μm con un criostato. Colorare le sezioni con una soluzione di ematossilina ed eosina (H&E) secondo i protocolli standard²⁸.

Risultati

Saggio della resazurina
Per prima cosa abbiamo esaminato la vitalità cellulare in vitro delle cellule mSVF. A tale scopo, abbiamo condotto un test di vitalità delle cellule di resazurina nei giorni 0, 3 e 7. La vitalità cellulare ai giorni 0, 3 e 7 di un totale di quattro campioni è mostrata nella Figura 1. I valori del giorno 0 fungono da base e sono stati impostati al 100%. Al giorno 3, il controllo positivo (mSVF) ha mostr...

Discussione

L'isolamento meccanico della SVF fornisce un'alternativa elegante al tradizionale approccio enzimatico e offre un ampio accesso per l'applicazione clinica²⁹. Infatti, la mSVF, come proposto nel presente manoscritto, è già in uso clinico per il trattamento delle cicatrici dei tessuti molli o come coadiuvante per le procedure cosmetiche³⁰. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo semplice per la somministrazione topica efficiente di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL