La combinazione di frazione vascolare stromale isolata meccanicamente e idrogel di fibrina: un protocollo di elaborazione

Riepilogo

La frazione vascolare stromale (SVF) isolata meccanicamente in combinazione con un idrogel di fibrina offre un vettore facile ed efficiente per cellule stromali vitali di derivazione adiposa per varie indicazioni, tra cui l'ingegneria tissutale e/o la guarigione delle ferite. Qui, presentiamo la preparazione di un costrutto meccanico di SVF (mSVF)-fibrina idrogel per la ricerca traslazionale e l'applicazione clinica.

Abstract

Il potenziale rigenerativo delle cellule stromali di derivazione adiposa (ASC) ha guadagnato un'attenzione significativa nella ricerca rigenerativa e traslazionale. In passato, l'estrazione di queste cellule dal tessuto adiposo richiedeva un processo enzimatico a più fasi, che risultava in un mix di cellule eterogenee costituito da ACS e altre cellule, che sono congiuntamente chiamate frazione vascolare stromale (SVF). I protocolli di isolamento SVF meccanico (mSVF) introdotti più di recente richiedono meno tempo e aggirano i problemi normativi. Recentemente abbiamo proposto un protocollo che genera mSVF ricca di cellule stromali basata su una combinazione di emulsione e centrifugazione. Un problema attuale nell'applicazione della mSVF per l'applicazione della terapia delle ferite è la mancanza di un'impalcatura che fornisca protezione dalla manipolazione meccanica e dall'essiccazione. In passato, gli idrogel di fibrina hanno dimostrato di essere un utile coadiuvante nel trasferimento cellulare per scopi di guarigione delle ferite. Nel lavoro qui presentato, delineiamo le fasi di preparazione di un costrutto di idrogel di fibrina mSVF come un nuovo approccio per la ricerca traslazionale e l'applicazione clinica.

Introduzione

Negli ultimi anni, la chirurgia plastica rigenerativa è emersa come un ulteriore pilastro della chirurgia plastica¹. La chirurgia plastica rigenerativa mira a ripristinare il tessuto danneggiato trasferendo fattori solubili, cellule e tessuti raccolti dal paziente per promuovere il ripristino dei tessuti in modo minimamente invasivo². Le cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) hanno attirato l'attenzione grazie alla loro capacità di differenziarsi in più linee mesenchimali, rendendole un candidato promettente per la ricerca sulla medicina rigenerativa

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti i donatori adulti hanno fornito il consenso informato scritto per consentire l'ulteriore utilizzo dei campioni di tessuto raccolti. Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana della nostra istituzione.

1. Raccolta del tessuto adiposo

1. Prelevare il tessuto adiposo eseguendo una liposuzione standard in una tecnica convenzionale di raccolta del grasso descritta in precedenti pubblicazioni^26,27. Assicurati di util....

Discussione

L'isolamento meccanico della SVF fornisce un'alternativa elegante al tradizionale approccio enzimatico e offre un ampio accesso per l'applicazione clinica²⁹. Infatti, la mSVF, come proposto nel presente manoscritto, è già in uso clinico per il trattamento delle cicatrici dei tessuti molli o come coadiuvante per le procedure cosmetiche³⁰. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo semplice per la somministrazione topica efficiente di .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL