Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

Riepilogo

Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.

Abstract

La mancanza di modelli tumorali convalidati che ricapitolino il microambiente tumorale dei tumori solidi in vitro rimane un collo di bottiglia significativo per la ricerca preclinica sul cancro e lo sviluppo terapeutico. Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato il microtumore vascolarizzato (VMT), o chip tumorale, un sistema microfisiologico che modella realisticamente il complesso microambiente tumorale umano. Il VMT si forma de novo all'interno di una piattaforma microfluidica mediante co-coltura di più tipi di cellule umane in condizioni di flusso dinamico e fisiologico. Questo costrutto microtumorale di ingegneria tissutale incorpora una rete vascolare perfusa vivente che supporta la massa tumorale in crescita proprio come fanno i vasi neoformati in vivo. È importante sottolineare che i farmaci e le cellule immunitarie devono attraversare lo strato endoteliale per raggiungere il tumore, modellando in vivo le barriere fisiologiche alla somministrazione e all'efficacia terapeutica. Poiché la piattaforma VMT è otticamente trasparente, è possibile ottenere l'imaging ad alta risoluzione di processi dinamici come lo stravaso di cellule immunitarie e le metastasi con la visualizzazione diretta delle cellule marcate con fluorescenza all'interno del tessuto. Inoltre, il VMT mantiene l'eterogeneità tumorale in vivo , le firme di espressione genica e le risposte ai farmaci. Praticamente qualsiasi tipo di tumore può essere adattato alla piattaforma e le cellule primarie dei tessuti chirurgici freschi crescono e rispondono al trattamento farmacologico nella VMT, aprendo la strada a una medicina veramente personalizzata. Qui vengono delineati i metodi per stabilire la VMT e utilizzarla per la ricerca oncologica. Questo approccio innovativo apre nuove possibilità per lo studio dei tumori e delle risposte ai farmaci, fornendo ai ricercatori un potente strumento per far progredire la ricerca sul cancro.

Introduzione

Il cancro rimane una delle principali preoccupazioni per la salute in tutto il mondo ed è la seconda causa di morte negli Stati Uniti. Solo per l'anno 2023, il National Center for Health Statistics prevede più di 1,9 milioni di nuovi casi di cancro e oltre 600.000 decessi per cancro negli Stati Uniti¹, evidenziando l'urgente necessità di approcci terapeutici efficaci. Tuttavia, attualmente, solo il 5,1% delle terapie antitumorali che entrano negli studi clinici alla fine ottiene l'approvazione della FDA. L'incapacità dei candidati promettenti di progredire con successo negli studi clinici può essere in parte attribuita all'uso di sistemi modell....

Protocollo

1. Progettazione e fabbricazione

1. Progettazione del dispositivo
   1. Per la fabbricazione di dispositivi microfluidici, creare uno stampo SU-8 utilizzando uno strato di 200 μm di SU-8 rivestito in spin su un wafer di silicio (RCA-1 pulito e trattato con acido fluoridrico (HF) al 2%), seguito da una singola fase di fotolitografia a maschera come descritto in precedenza ^8,9.
   2. Fondere una replica di polidimetilsilossano (PDMS) di 4 mm di spessore dallo stampo SU-8 per generare uno stampo in poliuretano durevole per le fasi di fabbricazione a valle. È possibile utilizzare vari....

Discussione

Quasi tutti i tessuti del corpo ricevono sostanze nutritive e ossigeno attraverso la vascolarizzazione, rendendolo un componente fondamentale per la modellazione realistica delle malattie e lo screening dei farmaci in vitro. Inoltre, diverse neoplasie maligne e stati patologici sono definiti dalla disfunzione endoteliale vascolare e dall'iperpermeabilità³. In particolare, nel cancro, la vascolarizzazione associata al tumore è spesso mal perfusa, interrotta e permeabile, agendo così com.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003