Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Riepilogo

Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Abstract

I trasportatori di soluti (SLC) sono trasportatori di membrana che importano ed esportano una serie di substrati endogeni ed esogeni, tra cui ioni, nutrienti, metaboliti, neurotrasmettitori e prodotti farmaceutici. Nonostante sia emerso come interessanti bersagli terapeutici e marcatori di malattia, questo gruppo di proteine è ancora relativamente poco drogato dai farmaci attuali. I progetti di scoperta di farmaci per questi trasportatori sono ostacolati da limitate conoscenze strutturali, funzionali e fisiologiche, in ultima analisi a causa delle difficoltà nell'espressione e nella purificazione di questa classe di proteine incorporate nella membrana. Qui, dimostriamo i metodi per ottenere quantità di milligrammi ad alta purezza di proteine trasportatrici SLC umane utilizzando sequenze geniche ottimizzate per il codone. In combinazione con un'esplorazione sistematica della progettazione dei costrutti e dell'espressione ad alto rendimento, questi protocolli garantiscono la conservazione dell'integrità strutturale e dell'attività biochimica delle proteine bersaglio. Evidenziamo anche i passaggi critici nell'espressione delle cellule eucariotiche, nella purificazione dell'affinità e nella cromatografia ad esclusione dimensionale di queste proteine. In definitiva, questo flusso di lavoro produce preparazioni proteiche pure, funzionalmente attive e stabili adatte per la determinazione della struttura ad alta risoluzione, studi di trasporto, saggi di coinvolgimento di piccole molecole e screening in vitro ad alto rendimento.

Introduzione

Le proteine di membrana sono state a lungo bersagli sia per i ricercatori che per le industrie farmaceutiche. Di questi, i trasportatori di soluti (SLC) sono una famiglia di oltre 400 geni trasportatori secondari codificati all'interno del genoma umano¹. Questi trasportatori sono coinvolti nell'importazione e nell'esportazione di numerose molecole, tra cui ioni², neurotrasmettitori³, lipidi 4,5,6,7, amminoacidi ⁸, nutrienti ^9,10,11 e prodotti farmaceutici

Protocollo

NOTA: Tutti i geni RESOLUTE SLC ottimizzati per codone sono stati depositati in AddGene⁴³, i cui link sono disponibili nell'elenco dei reagenti pubblici RESOLUTE⁴⁴. Questi geni sono stati clonati nel plasmide pDONR221 e consentono la clonazione diretta dei geni nel vettore di destinazione utilizzando la clonazione di ricombinazione⁴⁵. Per massimizzare il parallelismo, le cellule batteriche, di insetto e di mammifero vengono coltivate in formato blocco rispettivamente per la produzione di bacmid (sezione 3), l'amplificazione del baculovirus (sezione 5) e i test di espressione (sezione 6). Per quest....

Discussione

Lo sviluppo di terapie mirate a SLC è rimasto ostacolato a causa dell'assenza di una caratterizzazione sistematica della funzione del trasportatore. Ciò ha portato a un numero sproporzionato di farmaci che hanno come bersaglio questa classe proteica rispetto ai GPCR e ai canali ionici⁶³, nonostante i loro numerosi ruoli nei processi normali e fisiopatologici. RESOLUTE è un consorzio internazionale che mira a sviluppare tecniche e strumenti di ricerca all'avanguardia per accelerare e migliorare .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent