Un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistito da separazione magnetica per la produzione su larga scala di vescicole derivate da endosomi

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistita da separazione magnetica per la produzione su larga scala di nanovescicole derivate dall'endosoma come un nuovo tipo di mimici degli esosomi (EM) che condividono la stessa origine biologica e struttura, morfologia e composizione proteica simili delle vescicole extracellulari (EV) native.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) hanno attirato un'attenzione significativa nella ricerca fisiologica e patologica, nella diagnosi e nel trattamento delle malattie; Tuttavia, la loro traduzione clinica è stata limitata dalla mancanza di approcci di produzione su larga scala. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistito da separazione magnetica per la produzione su larga scala di nanovescicole derivate da endosomi come un nuovo tipo di mimici degli esosomi (EM) derivati dagli endosomi, che hanno una resa circa 100 volte superiore rispetto al metodo di ultracentrifugazione convenzionale. In questo metodo, le nanoparticelle magnetiche (MNP) sono state internalizzate dalle cellule parentali tramite endocitosi e sono state successivamente accumulate all'interno dei loro endosomi. Quindi, gli endosomi caricati con MNPs sono stati raccolti e purificati mediante trattamento ipotonico e separazione magnetica. Un omogeneizzatore ad alta velocità è stato utilizzato per rompere gli endosomi caricati con MNP in nanovescicole monodisperse. Le vescicole derivate dall'endosoma risultanti presentano la stessa origine biologica e struttura, caratterizzate dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal microscopio elettronico a trasmissione e dal western blotting. La loro morfologia e composizione proteica sono simili a quelle delle vescicole extracellulari native, il che indica che le vescicole extracellulari possono potenzialmente fungere da surrogato a basso costo e ad alto rendimento delle vescicole extracellulari native per le traduzioni cliniche.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole secrete da quasi tutte le cellule con una gamma di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm, contenenti abbondanti sostanze bioattive. A seconda della cellula di origine, le vescicole extracellulari mostrano un'elevata eterogeneità, possedendo più componenti specifiche per le cellule madri¹. Le vescicole extracellulari vengono rilasciate nei fluidi corporei e trasportate in siti distanti dove vengono assorbite dalle cellule bersaglio per l'azione², che può essere utilizzata per fornire un'ampia gamma di molecole bioattive e farmaci per la riparazione dei tessuti, la diag....

Protocollo

NOTA: Uno schema del metodo è mostrato nella Figura 1.

1. Preparazione e isolamento EM

1. Internalizzazione cellulare delle MNP
   1. Colture cellulari
      1. Sospendere 1 ×^{10 6} cellule staminali mesenchimali (BMSC) del midollo osseo di ratto, cellule 293T o cellule di carcinoma epiteliale ovarico di topo (ID8) in terreno completo DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e il 5% di soluzione di penicillina-streptomicina (P/S) in 2 mL per piastra a sei pozzetti (vedere Tabella dei materiali).
      2. Coltivare le cellule per una notte a 37 °C e al 5% d....

Discussione

Come surrogato della terapia cell-free e di un sistema di somministrazione di farmaci su scala nanometrica, le vescicole extracellulari devono ancora soddisfare le loro aspettative cliniche e un ostacolo principale è la mancanza di metodi di produzione e purificazione scalabili e riproducibili⁶. Pertanto, vari tipi di EM sono stati sviluppati come analoghi delle EV con complessità biologica simile¹⁴. Ad oggi, l'esempio EM più comunemente usato sono le nanovescicole deriv.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis