Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione

Riepilogo

L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.

Abstract

Nella microscopia elettronica criogenica (cryoEM), le macromolecole purificate vengono applicate a una griglia contenente una lamina di carbonio bucata; Le molecole vengono quindi tamponate per rimuovere il liquido in eccesso e congelate rapidamente in uno strato di ghiaccio vetroso spesso circa 20-100 nm, sospeso su fori di lamina larghi circa 1 μm. Il campione risultante viene ripreso utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e, dopo l'elaborazione dell'immagine utilizzando un software adatto, è possibile determinare strutture a risoluzione quasi atomica. Nonostante l'adozione diffusa di cryoEM, la preparazione dei campioni rimane un grave collo di bottiglia nei flussi di lavoro di cryoEM, con gli utenti che spesso incontrano sfide legate ai campioni che si comportano male nel ghiaccio vitreo sospeso. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per modificare le griglie crioEM con un singolo strato continuo di grafene, che funge da superficie di supporto che spesso aumenta la densità delle particelle nell'area ripresa e può ridurre le interazioni tra le particelle e l'interfaccia aria-acqua. Qui, forniamo protocolli dettagliati per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM e per valutare rapidamente l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Inoltre, descriviamo un metodo basato su EM per confermare la presenza di grafene visualizzando il suo caratteristico modello di diffrazione. Infine, dimostriamo l'utilità di questi supporti di grafene ricostruendo rapidamente una mappa di densità con risoluzione di 2,7 Å di un complesso Cas9 utilizzando un campione puro a una concentrazione relativamente bassa.

Introduzione

La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) si è evoluta in un metodo ampiamente utilizzato per la visualizzazione di macromolecole biologiche¹. Alimentata dai progressi nel rilevamento diretto degli elettroni ^2,3,4, nell'acquisizione dati⁵ e negli algoritmi di elaborazione delle immagini ^6,7,8,9,10, la crioEM è ora in grado di produrre strutture 3D a risoluzione quas....

Protocollo

1. Preparazione del grafene CVD

1. Preparare la soluzione di incisione al grafene come descritto di seguito.
   1. Sciogliere 4,6 g di persolfato di ammonio (APS) in 20 mL di acqua di grado molecolare in un becher da 50 mL per una soluzione 1 M e coprire con un foglio di alluminio. Lasciare che l'APS si dissolva completamente mentre si procede al passaggio 1.2.
2. Preparare una sezione di grafene CVD per il rivestimento in metacrilato di metile (MMA). Taglia con cura una sezione quadrata di grafene CVD. Trasferire il quadrato su un vetrino coprioggetto (50 mm x 24 mm) all'interno di una capsula di Petri pulita e coprire dura....

Discussione

La preparazione dei campioni CryoEM comporta una serie di sfide tecniche, con la maggior parte dei flussi di lavoro che richiedono ai ricercatori di manipolare manualmente le griglie fragili con estrema cura per evitare di danneggiarle. Inoltre, l'idoneità di qualsiasi campione alla vetrificazione è imprevedibile; Le particelle spesso interagiscono con l'interfaccia aria-acqua o con la lamina di supporto solida che si sovrappone alle griglie, il che può portare le particelle ad adottare gli orientamenti preferiti o a .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216