Fabbricazione e caratterizzazione di organoidi di cancro del colon-retto da una linea cellulare SW1222 in una matrice peptidica autoassemblante ultracorta

Riepilogo

Questo protocollo mira a valutare peptidi biofunzionali autoassemblanti per l'adesione cellulare, la morfologia degli organoidi e l'espressione genica mediante immunocolorazione. Utilizzeremo una linea cellulare di cancro del colon-retto per fornire un modo economico per ottenere organoidi per test intensivi.

Abstract

I peptidi autoassemblanti ultracorti (SAP) possono formare spontaneamente nanofibre che assomigliano alla matrice extracellulare. Queste fibre consentono la formazione di idrogel biocompatibili, biodegradabili e non immunogenici. Abbiamo precedentemente dimostrato che i SAP, quando biofunzionalizzati con motivi derivati da proteine, possono imitare le caratteristiche della matrice extracellulare che supportano la formazione di organoidi colorettali. Questi idrogel peptidici biofunzionali mantengono le proprietà meccaniche, la sintonizzabilità e la stampabilità del peptide genitore originale, incorporando segnali che consentono alle interazioni cellula-matrice di aumentare l'adesione cellulare. Questo articolo presenta i protocolli necessari per valutare e caratterizzare gli effetti di vari idrogel peptidici biofunzionali sull'adesione cellulare e sulla formazione del lume utilizzando una linea cellulare di adenocarcinoma tumorale in grado di formare organoidi di cancro del colon-retto in modo economico. Questi protocolli aiuteranno a valutare gli effetti biofunzionali dell'idrogel peptidico sull'adesione cellulare e sulla formazione di luminali utilizzando l'immunocolorazione e l'analisi delle immagini a fluorescenza. La linea cellulare utilizzata in questo studio è stata precedentemente utilizzata per la generazione di organoidi in matrici di origine animale.

Introduzione

Negli ultimi anni, i peptidi autoassemblanti (SAP) sono emersi come biomateriali promettenti per applicazioni di ingegneria tissutale. I SAPs possiedono proprietà uniche, tra cui la formazione spontanea di nanofibre, la biocompatibilità, la biodegradabilità e la non immunogenicità, che li rendono candidati interessanti per lo sviluppo di scaffold¹. I SAP sono stati precedentemente utilizzati insieme a vari tipi di cellule e, in particolare, i SAP ultracorti hanno facilitato l'incapsulamento delle cellule staminali, mantenendo la loro pluripotenza per periodi prolungati che comprendono più di 30 passaggi e con un'incidenza ....

Protocollo

1. Preparazione del tampone e della soluzione

NOTA: Tutte le concentrazioni indicate sono concentrazioni finali.

1. Aggiungere siero fetale bovino (FBS) e penicillina-streptomicina a una concentrazione finale rispettivamente del 10% e dell'1% per preparare il terreno di Dulbecco modificato (IMDM) completo di Iscove. Conservare al buio a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Mescolare MgCl₂ (3 mM), saccarosio (300 mM) e Triton X-100 (0,5%) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per preparare il tampone di permeabilizzazione. Conservare questa soluzione a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
3. Combin....

Discussione

L'enorme potenziale dei SAP nella ricerca biomedica è sottolineato dalla loro malleabilità e adattabilità attraverso la biofunzionalizzazione. Con una gamma così ampia di permutazioni, la sfida si presenta nel testare e determinare in modo efficiente le configurazioni più promettenti per applicazioni specifiche, in particolare nella ricerca sugli organoidi. Una soluzione rapida ed economica è fondamentale. La linea cellulare SW1222, derivata da adenocarcinoma colorettale umano, emerge come un candidato fondamentale.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015