Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Riepilogo

Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .

Abstract

La chiusura del tubo neurale (NTC) è un processo critico durante lo sviluppo embrionale. Il fallimento di questo processo può portare a difetti del tubo neurale, causando malformazioni congenite o addirittura la mortalità. L'NTC coinvolge una serie di meccanismi a livello genetico, molecolare e meccanico. Sebbene la regolazione meccanica sia diventata un argomento sempre più interessante negli ultimi anni, rimane in gran parte inesplorata a causa della mancanza di una tecnologia adeguata per condurre test meccanici del tessuto embrionale 3D in situ. In risposta, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche del tessuto embrionale di pollo in modo non invasivo e senza contatto. Ciò si ottiene integrando un microscopio confocale Brillouin con un sistema di incubazione sul palco. Per sondare la meccanica dei tessuti, un embrione pre-coltivato viene raccolto e trasferito in un'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo . Allo stesso tempo, le immagini meccaniche del tessuto della placca neurale vengono acquisite dal microscopio Brillouin in diversi momenti durante lo sviluppo. Questo protocollo include descrizioni dettagliate della preparazione del campione, l'implementazione degli esperimenti di microscopia di Brillouin e la post-elaborazione e l'analisi dei dati. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono studiare longitudinalmente l'evoluzione meccanica del tessuto embrionale durante lo sviluppo.

Introduzione

I difetti del tubo neurale (NTD) sono gravi difetti congeniti del sistema nervoso centrale causati da errori nella chiusura del tubo neurale (NTC) durante lo sviluppo embrionale¹. L'eziologia delle NTD è complessa. Gli studi hanno dimostrato che l'NTC coinvolge una sequenza di processi morfogenetici, tra cui l'estensione convergente, la flessione della placca neurale (ad esempio, la costrizione apicale), l'elevazione della piega neurale e infine l'adesione della piega neurale. Questi processi sono regolati da molteplici meccanismi molecolari e genetici ^2,3 e qualsi....

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Wayne State University.

1. Preparazione sperimentale

1. Usa una soluzione di etanolo al 70% per pulire e sterilizzare le forbici e le pinzette. Inoltre, prepara pipette monouso e una siringa.
2. Preparare un mezzo di lavaggio aggiungendo 3.595 g di NaCl a 495 ml di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 5 ml di Penicillina-Streptomicina (5 U/mL) al terreno. Riempire una capsula di Petri da 100 mm con il mezzo di lavaggio e riscaldarla a 37 °C.
3. Preparare i piatti di coltura secondo la Figura 1

Discussione

Lo sviluppo precoce dell'embrione può essere facilmente influenzato da disturbi esterni. Pertanto, è necessaria la massima cautela durante l'estrazione e il trasferimento del campione. Un potenziale problema è il distacco dell'embrione dalla carta da filtro, che può portare al restringimento della membrana vitellina e provocare un artefatto inclinato della placca neurale nell'imaging di Brillouin. Inoltre, questo restringimento può arrestare lo sviluppo dell'embrione. È necessario prestare attenzione a diversi pass.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set