Riutilizzo della provetta per ultracentrifuga in policarbonato nelle analisi proteomiche delle vescicole extracellulari

Riepilogo

Viene fornito un protocollo dettagliato per la pulizia e il riutilizzo delle provette per ultracentrifuga in policarbonato per eseguire l'isolamento delle vescicole extracellulari adatto per esperimenti di proteomica.

Abstract

Le plastiche monouso da laboratorio aggravano la crisi dell'inquinamento e contribuiscono ai costi dei materiali di consumo. Nell'isolamento delle vescicole extracellulari (EV), le provette per ultracentrifuga in policarbonato (UC) vengono utilizzate per sopportare le elevate forze centrifughe associate. La proteomica EV è un campo in progresso e mancano protocolli di riutilizzo convalidati per questi tubi. Il riutilizzo dei materiali di consumo per i protocolli di isolamento delle proteine a basso rendimento e la proteomica a valle richiede la compatibilità dei reagenti con le acquisizioni di spettroscopia di massa, come l'assenza di contaminazione da polimeri sintetici derivati da provette da centrifuga e una sufficiente rimozione delle proteine residue.

Questo protocollo descrive e convalida un metodo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per il riutilizzo in esperimenti di proteomica EV. Il processo di pulizia prevede l'immersione immediata dei tubi UC in H₂O per prevenire l'essiccazione delle proteine, il lavaggio in detergente dodecilsolfato di sodio (SDS) allo 0,1%, il risciacquo in acqua calda del rubinetto, acqua demineralizzata ed etanolo al 70%. Per convalidare il protocollo di riutilizzo delle provette UC per la proteomica delle vescicole extracellulari a valle, sono state ottenute provette usate a seguito di un esperimento che isolava le vescicole extracellulari dal tessuto cardiovascolare utilizzando la colite ulcerosa differenziale e la separazione del gradiente di densità. Le provette sono state pulite e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni EV confrontando provette UC vuote mai utilizzate con provette UC pulite. I pellet pseudo-EV ottenuti dalle procedure di isolamento sono stati lisati e preparati per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem utilizzando un kit di preparazione del campione proteico commerciale con modifiche per campioni proteici a bassa abbondanza.

Dopo la pulizia, il numero di proteine identificate è stato ridotto del 98% nello pseudo-pellet rispetto al precedente campione di isolamento EV dalla stessa provetta. Confrontando una provetta pulita con una provetta vuota, entrambi i campioni contenevano un numero molto piccolo di proteine (≤20) con una somiglianza dell'86%. È stata confermata l'assenza di picchi polimerici nei cromatogrammi delle provette pulite. In definitiva, la validazione di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all'arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e abbasserà i costi sperimentali.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle delimitate da doppio strato lipidico rilasciate da cellule che trasportano carichi biologicamente attivi, come le proteine, e partecipano a vari processi biologici, tra cui la comunicazione cellula-cellula e la formazione di mineralizzazione biologica¹. Queste particelle si trovano in tutti i fluidi e tessuti corporei e le loro attività biologiche e usi sono un campo di ricerca scientifica in rapida evoluzione. L'isolamento e la convalida di queste nanoparticelle presentano varie sfide a causa delle loro piccole dimensioni e della biosimilarità con altre particelle, come liposomi e aggregati prot....

Protocollo

1. Pulizia del tubo

NOTA: La procedura di isolamento EV utilizza tubi UC in policarbonato con e senza tappo (descritti di seguito). La stessa procedura è stata seguita sia per le provette tappate che per quelle non tappate. Nel caso dei tubi tappati, le parti del coperchio sono state pulite singolarmente e rimontate dopo l'asciugatura e il pre-stoccaggio.

1. Dopo l'uso iniziale delle provette in policarbonato e la rimozione del campione, immergere immediatamente le provette UC in acqua di rubinetto per evitare che il campione si secchi sul lato della provetta.
2. Trasferire e immergere le provette in dodecil s....

Discussione

Qui descriviamo e convalidiamo un protocollo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per l'arricchimento di veicoli elettrici e applicazioni proteomiche. Abbiamo dimostrato il successo della rimozione della proteina residua dal precedente campione di provetta UC rispetto a un'analisi pseudo-pellet pulita al di sotto del limite di rilevamento di questo protocollo di acquisizione con spettrometria di massa e abbiamo mostrato la somiglianza proteomica della provetta UC vuota mai utilizzata rispetto agli pseudo pellet de.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent