Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Riepilogo

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

Abstract

La cornea è un tessuto trasparente che copre l'occhio ed è fondamentale per una visione chiara. È il tessuto più innervato del corpo. Questa innervazione fornisce sensibilità e funzione trofica all'occhio e contribuisce a preservare l'integrità corneale. L'interruzione patologica di questa innervazione è definita cheratite neurotrofica. Questo può essere innescato da lesioni all'occhio, interventi chirurgici o malattie. In questo studio, proponiamo tre diversi protocolli per infliggere danni all'innervazione in modi che ricapitolano i tre tipi di casi generalmente riscontrati in clinica.

Il primo metodo consiste nell'effettuare un'abrasione dell'epitelio con una fresa oftalmica. Ciò comporta la rimozione dello strato epiteliale, delle terminazioni nervose libere e del plesso sottobasale in modo simile all'intervento di cheratectomia fotorefrattiva eseguito in clinica. Il secondo metodo mira solo all'innervazione sezionandola alla periferia con un punzone da biopsia, mantenendo l'integrità dell'epitelio. Questo metodo è simile alle prime fasi della cheratoplastica lamellare e porta a una degenerazione dell'innervazione seguita dalla ricrescita degli assoni nella cornea centrale. L'ultimo metodo danneggia l'innervazione di un modello murino transgenico utilizzando un microscopio multifotone, che localizza in modo specifico il sito di cauterizzazione delle fibre nervose fluorescenti. Questo metodo infligge gli stessi danni della fotocheratite, una sovraesposizione alla luce UV.

Questo studio descrive diverse opzioni per studiare la fisiopatologia dell'innervazione corneale, in particolare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni. Promuovere la rigenerazione è fondamentale per evitare complicazioni come difetti dell'epitelio o persino la perforazione della cornea. I modelli proposti possono aiutare a testare nuove molecole farmacologiche o terapie geniche che migliorano la rigenerazione nervosa e limitano la progressione della malattia.

Introduzione

La cornea, che è la superficie trasparente dell'occhio, è composta da tre strati distinti: l'epitelio, lo stroma e l'endotelio. Questo organo ha la più alta densità di innervazione nel corpo ed è composto principalmente da fibre sensoriali (tipi Aδ e C) che originano dal ramo oftalmico del ganglio trigemino. Le fibre sensoriali penetrano nella periferia della cornea nello stroma medio sotto forma di grandi fasci che si ramificano per coprire la superficie. Quindi si biforcano per perforare la membrana di Bowmann e formare il plesso sottobasale, che è facilmente riconoscibile per la formazione di un vortice al centro della cornea. Queste fibre terminano come terminazio....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal National Animal Experiment Board.

1. Preparativi

1. Preparare una soluzione anestetica di ketamina-xilazina per l'anestesia. Iniettare ketamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluendo 200 μL di ketamina (100 mg/mL) e 125 μL di xilazina (20 mg/mL) in 2.175 mL di NaCl sterile allo 0,9%.
2. Preparare una soluzione 0,02 mg/mL di buprenorfina come soluzione analgesica aggiungendo 100 μL di buprenorfina 0,3 mg/mL a 1.400 mL di NaCl sterile allo 0,9%.
3. Preparare la soluzione colorante fluorescente.
   1. Utilizzare una bilancia fine per pesare 10 mg ....

Discussione

La cheratite neurotrofica è considerata una malattia rara, che colpisce 5 individui su 10.000. Tuttavia, le persone che soffrono di NK a causa di una lesione fisica come ustioni chimiche o sindromi come il diabete o la sclerosi multipla non sono incluse in tali statistiche³. Inoltre, questa condizione rimane significativamente sottodiagnosticata²² e la prevalenza della malattia è sottostimata. C'è un forte bisogno di nuovi trattamenti e terapie che promuovano la rigenera.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium