Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare dai topi

Riepilogo

Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare (CD34⁺ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

Abstract

Le cellule staminali e progenitrici residenti nella parete vascolare CD34⁺ (VW-SC) sono sempre più riconosciute per il loro ruolo cruciale nella regolazione del danno vascolare e della riparazione. Stabilire un metodo stabile ed efficiente per coltivare VW-SC CD34⁺ murini funzionali è essenziale per studiare ulteriormente i meccanismi coinvolti nella proliferazione, migrazione e differenziazione di queste cellule in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Il metodo descritto combina lo screening a biglie magnetiche e la citometria a flusso per purificare i VW-SC CD34⁺ residenti primari in coltura. Le cellule purificate vengono quindi identificate funzionalmente attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'imaging con Ca²⁺ . In breve, le cellule vascolari dall'avventizia dell'aorta murina e dell'arteria mesenterica vengono ottenute attraverso l'attacco di blocchi di tessuto, seguito da subcoltura fino a raggiungere una conta cellulare di almeno 1 × 10⁷. Successivamente, i VW-SC CD34⁺ vengono purificati mediante smistamento a biglie magnetiche e citometria a flusso. L'identificazione delle VW-SC CD34⁺ comporta la colorazione con immunofluorescenza cellulare, mentre la multipotenza funzionale viene determinata esponendo le cellule a un terreno di coltura specifico per la differenziazione orientata. Inoltre, il rilascio funzionale interno di Ca²⁺ e l'ingresso esterno di Ca²⁺ vengono valutati utilizzando una workstation di imaging disponibile in commercio in cellule caricate con Fura-2/AM esposte ad ATP, caffeina o tapsigargina (TG). Questo metodo offre una tecnica stabile ed efficiente per isolare, coltivare e identificare le cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare, fornendo l'opportunità di studi in vitro sui meccanismi regolatori delle VW-SC e lo screening di farmaci mirati.

Introduzione

La parete vascolare svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo vascolare, nella regolazione omeostatica e nella progressione delle malattie vascolari. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno svelato la presenza di vari lignaggi di cellule staminali nelle arterie. Nel 2004, il gruppo del professor Qingbo Xu ha riportato per la prima volta l'esistenza di cellule staminali/progenitrici vascolari nella periferia della parete vascolare adulta, che esprimono CD34, Sca-1, c-kit e Flk-1¹. Queste cellule staminali vascolari mostrano un potenziale di differenziazione e proliferazione multidirezionale. In condizioni normali, rimangono relativamente quies....

Protocollo

Questo studio è stato approvato e gli animali sono stati gestiti in conformità con le linee guida per la gestione e l'uso di animali da laboratorio in Cina. La ricerca ha aderito rigorosamente ai requisiti etici degli esperimenti sugli animali, con l'approvazione del Comitato Etico Animale (Numero di approvazione: SWMU2020664). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57BL/6 sani di otto settimane di entrambi i sessi, di peso compreso tra 18 e 20 g. Gli animali sono stati ospitati presso il Laboratory Animal Center della Southwest Medical University (SWMU).

1. Coltura a blocchi tissutali di avventizia da aorta e arterie mese....

Discussione

Questo studio fornisce un metodo rapido e conveniente per ottenere VW-SC CD34⁺ funzionali dall'aorta e dalle arterie mesenteriche dei topi. I VW-SC CD34⁺ ottenuti con questo metodo hanno attività proliferativa e proprietà di differenziazione multidirezionale. I recettori del trifosfato inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP₃Rs), i recettori della rianodina (RyRs) e i canali del calcio gestiti in negozio mediano il rilascio e l'ingresso di Ca²⁺ nelle VW-SC CD34⁺ . L'istitu.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023