Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Riepilogo

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per l'approvvigionamento di un pancreas suino per l'isolamento e la purificazione delle isole.

Abstract

Il trapianto di isole pancreatiche è un trattamento emergente per il diabete di tipo I; Tuttavia, è limitato dalla corrispondenza e dalla disponibilità dei donatori. Lo xenotrapianto di isole suine offre un'alternativa promettente all'allotrapianto, con il potenziale per la produzione su larga scala di isole funzionali su richiesta. La resa e la vitalità delle isole isolate è altamente suscettibile alla qualità del pancreas donatore e al metodo di approvvigionamento, in particolare alla durata del tempo di ischemia calda. Per migliorare la conservazione degli organi e la successiva resa e vitalità delle isole matrici, abbiamo sviluppato un protocollo per la perfusione chirurgica e la resezione del pancreas suino. Questo protocollo impiega l'incannulamento aortico infrarenale diretto e la perfusione d'organo per ridurre al minimo il tempo di ischemia calda e semplificare la procedura per gli operatori che non dispongono di una vasta esperienza chirurgica. La successiva perfusione arteriosa del pancreas attraverso l'aorta elimina il sangue stagnante dalla microvascolarizzazione, riducendo così la trombosi e il danno ossidativo al tessuto. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per la perfusione chirurgica e la resezione del pancreas suino, seguita dall'isolamento e dalla purificazione delle isole suine.

Introduzione

Il diabete di tipo 1 è causato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta pancreatiche¹. Di conseguenza, i pazienti sono dipendenti dall'insulina esogena, esponendoli a fluttuazioni glicemiche ad alto rischio con episodi di iper- e ipoglicemia². L'allotrapianto di isole è una potenziale cura per il diabete di tipo I; Tuttavia, la limitata disponibilità di donatori di organi pancreatici rimane un ostacolo importante all'adozione diffusa della procedura ^2,3. Lo xenotrapianto di isole da donatori suini è un'alternativa promette....

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Divisione di Medicina Comparata della Washington University School of Medicine. I suini adulti dello Yorkshire di peso compreso tra 35 e 35 kg sono ideali per questa procedura; Tuttavia, il protocollo può essere adattato per suini di diverse dimensioni a seconda del contesto sperimentale. L'intera procedura deve essere eseguita in modo sterile in una sala operatoria.

1. Preparazione preoperatoria e anestesia

1. Sedare il maiale con un cocktail di 4 mg/kg di....

Discussione

Lo xenotrapianto di isole pancreatiche con donatori suini è una strategia promettente per il trattamento del diabete di tipo I. L'isolamento delle isole è impegnativo e la vitalità e la resa finale delle isole sono altamente suscettibili all'ipotensione e all'ischemia tissutale riscontrate durante l'approvvigionamento degli organi^16,17. Per ottimizzare l'approvvigionamento e la conservazione del pancreas, questo protocollo pre.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M NaOH, 100 mL	Millipore Sigma	1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)	Thermo Fisher	14065056
1x D-PBS, 500 mL	Thermo Fisher	14200075
1x HBSS, 1 L	Thermo Fisher	14025076
250 mL Conical Tubes	Millipore Sigma	CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]	Millipore Sigma	PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%	Millipore Sigma	25655-41-8
BioRad Gradient Former	BioRad	395
Calcium Chloride dihydrate	Thermo Fisher	10035-04-8
COBE Cell Processor	Ebay	317690
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L	Thermo Fisher	10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher	85190
Dithizone	Thermo Fisher	60-10-6
Gradient Former Connection Kit	BioRad	1652008
Heparin [1000 U/mL]	Emergency Medical Products	0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL	Thermo Fisher	15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL	Celprogen	HSA2001-25-1
Isoflurane	Covetrus	Item#:11695067772
Ketamine	Patterson	Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg)	Millipore Sigma	5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher	L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL	Cedarlane Labs	CL5020
Masterflex LS 16 Tubing	Masterfle	96419-16
Masterflex Peristaltic Pump	Masterflex	07522-30
PenStrep (2 mg/mL)	Celprogen	PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)	Dornase Alfa	8931278
Recovery Medium, PIM(R)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-R001GMP
RPMI 1640	Millipore Sigma	R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C	Patterson	Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L	Global Transplant Solutions	1000-0046-06
Waterbath	Sigma Alderich	CLS6783-1EA
Xylazine	Patterson	Item #:07-891-6165