Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Riepilogo

Il presente protocollo descrive saggi di infezione per interrogare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare di Shigella utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro .

Abstract

Il patogeno batterico enterico adattato all'uomo Shigella causa milioni di infezioni ogni anno, crea effetti di crescita a lungo termine tra i pazienti pediatrici ed è una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo. L'infezione induce diarrea acquosa o sanguinolenta a causa dell'agente patogeno che transita nel tratto gastrointestinale e infetta le cellule epiteliali che rivestono il colon. Con l'aumento sbalorditivo della resistenza agli antibiotici e l'attuale mancanza di vaccini approvati, i protocolli di ricerca standardizzati sono fondamentali per studiare questo formidabile agente patogeno. In questo articolo, vengono presentate metodologie per esaminare la patogenesi molecolare della Shigella utilizzando analisi in vitro dell'aderenza batterica, dell'invasione e della replicazione intracellulare nelle cellule epiteliali del colon. Prima delle analisi dell'infezione, il fenotipo di virulenza delle colonie di Shigella è stato verificato mediante l'assorbimento del colorante rosso Congo su piastre di agar. Durante la coltura batterica possono essere presi in considerazione anche terreni di laboratorio integrati per simulare le condizioni in vivo . Le cellule batteriche vengono quindi utilizzate in un protocollo standardizzato per infettare le cellule epiteliali del colon nelle piastre di coltura tissutale a una molteplicità stabilita di infezione con adattamenti per analizzare ogni fase dell'infezione. Per i saggi di aderenza, le cellule di Shigella vengono incubate con livelli di terreno ridotti per promuovere il contatto batterico con le cellule epiteliali. Sia per i saggi di invasione che per quelli di replicazione intracellulare, la gentamicina viene applicata per vari intervalli di tempo per eliminare i batteri extracellulari e consentire la valutazione dell'invasione e/o la quantificazione dei tassi di replicazione intracellulare. Tutti i protocolli di infezione enumerano i batteri aderenti, invasi e/o intracellulari diluendo in serie i lisati di cellule epiteliali infette e placcando le unità formanti colonie batteriche rispetto ai titoli infettivi sulle piastre di agar rosso del Congo. Insieme, questi protocolli consentono una caratterizzazione e un confronto indipendenti per ogni fase dell'infezione da Shigella delle cellule epiteliali per studiare con successo questo patogeno.

Introduzione

Le malattie diarroiche causate da patogeni batterici enterici rappresentano un onere significativo per la salute globale. Nel 2016, le malattie diarroiche sono state responsabili di 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo e sono state la quarta causa di morte nei bambini di età inferiore ai cinque anni^(1,2). Il patogeno batterico enterico Gram-negativo Shigella è l'agente eziologico della shigellosi, una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo³. La shigellosi causa ogni anno una significativa morbilità e mortalità nei bambini dei paesi a basso e medio r....

Protocollo

1. Preparazione di reagenti e materiali

NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti.

1. TSB mezzo: Aggiungere 0,5 L di acqua deionizzata (DI) a 15 g di brodo di soia triptico (TSB, vedi tabella dei materiali) e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
2. Terreno di sali biliari (TSB + BS): Per preparare TSB contenente lo 0,4% (p/v) di sali biliari, risospendere 0,06 g di sali biliari (BS, vedere la tabella dei materiali) in 15 mL di TSB sterilizzato in autoclave. Sterilizzare con filtro utilizzando un filtro PES da 0,22 μm.
   NOTA....

Discussione

Questo protocollo descrive una serie di tre saggi standardizzati per studiare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare delle cellule epiteliali intestinali della Shigella. Sebbene questi metodi siano semplicemente versioni modificate dei classici saggi di gentamicina utilizzati per studiare l'invasione e la replicazione intracellulare di vari patogeni batterici all'interno delle cellule ospiti 49,50,51, è necessario applicare considerazioni speciali quando si <.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media