Saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per la misurazione delle interazioni di CRAF con proteine 14-3-3 in cellule vive

Riepilogo

Questo protocollo descrive un saggio basato su BRET per misurare le interazioni della chinasi CRAF con le proteine 14-3-3 in cellule vive. Il protocollo delinea i passaggi per la preparazione delle celle, la lettura delle emissioni BRET e l'analisi dei dati. Viene inoltre presentato un risultato di esempio con l'identificazione dei controlli appropriati e la risoluzione dei problemi per l'ottimizzazione del saggio.

Abstract

La CRAF è un effettore primario delle GTPasi RAS e svolge un ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS. Inoltre, la CRAF è un hotspot per le mutazioni germinali, che hanno dimostrato di causare la RASopathy evolutiva, la sindrome di Noonan. Tutte le chinasi RAF contengono più siti di legame dipendenti dalla fosforilazione per le proteine regolatorie 14-3-3. Il legame differenziale di 14-3-3 a questi siti gioca un ruolo essenziale nella formazione di dimeri attivi di RAF sulla membrana plasmatica in condizioni di segnalazione e nel mantenimento dell'autoinibizione di RAF in condizioni di quiescenza. Comprendere come queste interazioni sono regolate e come possono essere modulate è fondamentale per identificare nuovi approcci terapeutici che mirano alla funzione dei RAF. Qui, descrivo un saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive. In particolare, questo test misura le interazioni di CRAF fuso a un donatore di nano luciferasi e 14-3-3 fuso a un accettore di tag Halo, dove l'interazione di RAF e 14-3-3 determina il trasferimento di energia da donatore a accettore e la generazione del segnale BRET. Il protocollo mostra inoltre che questo segnale può essere interrotto da mutazioni che hanno dimostrato di impedire il legame di 14-3-3 a ciascuno dei suoi siti di attracco RAF ad alta affinità. Questo protocollo descrive le procedure per la semina, la trasfetzione e la riplaccatura delle cellule, insieme a istruzioni dettagliate per la lettura delle emissioni di BRET, l'esecuzione dell'analisi dei dati e la conferma dei livelli di espressione proteica. Inoltre, vengono forniti esempi di risultati dei saggi, insieme alle fasi di ottimizzazione e risoluzione dei problemi.

Introduzione

Le chinasi RAF (ARAF, BRAF e CRAF) sono gli effettori diretti delle GTPasi RAS e i membri iniziatori della cascata chinasica RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-sopravvivenza. Studi recenti hanno dimostrato che l'espressione di CRAF svolge un ruolo chiave nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS, tra cui il carcinoma polmonare non a piccole cellule e l'adenocarcinoma duttale pancreatico 1,2,3,4,5. Inoltre, le mutazioni germinali della CRAF causano una forma particolarmente grave di RASopathy, la s....

Protocollo

NOTA: Questo test viene eseguito in celle 293FT. Una linea epiteliale ben caratterizzata e facilmente trasfettabile derivata da cellule renali embrionali umane. Una singola piastra di coltura confluente di 10 cm di queste cellule fornisce in genere cellule sufficienti per la semina di 20 pozzetti di piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. Le fasi 1-3 devono essere eseguite utilizzando una tecnica sterile in una cappa di sicurezza biologica.

1. Semina cellulare (giorno 1)

NOTA: In questa fase, le cellule vengono staccate dalle piastre di coltura tissutale, contate e seminate in piastre di coltura....

Discussione

Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine 14-3-3 svolgono un ruolo critico sia nell'attivazione che nell'inibizione delle chinasi RAF. Comprendere come questi eventi di legame sono regolati e gli effetti della modulazione di queste interazioni sulla segnalazione RAF e sull'oncogenesi guidata da RAF potrebbe scoprire nuove vulnerabilità terapeutiche che mirano alla funzione di CRAF. Tuttavia, il ciclo di attivazione di Raf è supportato da una pletora di proteine associate, modifiche post-traduzionali e cambiamen.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228