Preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica

Riepilogo

Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati per la preparazione di campioni retinici per la microscopia elettronica volumetrica, concentrandosi sulle caratteristiche strutturali dei terminali dei fotorecettori retinici.

Abstract

La microscopia elettronica volumetrica (Volume EM) è emersa come un potente strumento per visualizzare la struttura 3D di cellule e tessuti con precisione a livello nanometrico. All'interno della retina, vari tipi di neuroni stabiliscono connessioni sinaptiche negli strati plessiformi interno ed esterno. Sebbene le tecniche EM convenzionali abbiano fornito preziose informazioni sugli organelli subcellulari della retina, il loro limite risiede nel fornire dati di immagini 2D, che possono ostacolare misurazioni accurate. Ad esempio, quantificare le dimensioni di tre distinti pool di vescicole sinaptiche, cruciali per la trasmissione sinaptica, è difficile in 2D. Volume EM offre una soluzione fornendo dati 3D su larga scala e ad alta risoluzione. Vale la pena notare che la preparazione del campione è una fase fondamentale dell'EM del volume, che influisce in modo significativo sulla nitidezza e sul contrasto dell'immagine. In questo contesto, delineiamo un protocollo di preparazione del campione per la ricostruzione 3D dei terminali degli assoni fotorecettoriali nella retina. Questo protocollo include tre passaggi chiave: dissezione e fissazione della retina, processi di inclusione del campione e selezione dell'area di interesse.

Introduzione

La retina è densamente piena di assoni neuronali e dendriti intrecciati che formano sinapsi tra di loro¹. La microscopia è uno strumento indispensabile per lo studio dell'anatomia retinica in quanto ha strutture fini, intricate e piccole. Sebbene la microscopia elettronica (EM) fornisca una potenza senza pari per studiare l'ultrastruttura degli organelli subcellulari e la localizzazione accurata di proteine specifiche a livello nanometrico², produce immagini limitate al piano bidimensionale (2D), portando a una potenziale perdita di informazioni chiave.

Lo svi....

Protocollo

I protocolli per la cura e l'uso degli animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Wenzhou e hanno seguito le linee guida stabilite dall'Associazione per la Ricerca in Visione e Oftalmologia (ARVO). Tutti i topi sono stati mantenuti in un ciclo di luce di 12 ore e buio e sono stati alimentati con una dieta chow standard.

1. Dissezione e fissazione della retina

1. Anestetizzare i topi (C57BL/6J, maschio, 8 settimane, 20-25 g) iniettando 2,2,2-tribromoetanolo (0,25 mg/g di peso corporeo) per via intraperitoneale. Confermare la profondità dell'anestesi....

Discussione

Abbiamo implementato il protocollo di preparazione del campione Volume EM di OTO per analizzare la struttura terminale dei fotorecettori nel tessuto retinico. L'attenzione si è concentrata sui dettagli dell'intera procedura, a partire dal distacco e dalla fissazione della retina fino alla presentazione dei risultati della ricostruzione 3D dei terminali degli assoni dei fotorecettori.

La caratteristica distintiva del tessuto retinico, a differenza del tessuto .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049