Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Riepilogo

L'attuale studio mostra protocolli per valutare l'impegno precoce del destino delle cellule T_FH specifiche del virus e manipolare l'espressione genica in queste cellule.

Abstract

Le cellule T helper follicolari (T_FH) sono percepite come una linea di cellule T CD4⁺ indipendente che aiuta le cellule B affini a produrre anticorpi ad alta affinità, stabilendo così un'immunità umorale a lungo termine. Durante l'infezione virale acuta, l'impegno del destino delle cellule T_FH specifiche del virus è determinato nella fase iniziale dell'infezione e le indagini sulle cellule T_FH differenziate precocemente sono cruciali per comprendere l'immunità umorale dipendente dalle cellule T e ottimizzare la progettazione del vaccino. Nello studio, utilizzando un modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV) e il topo TCR-transgenico SMARTA (SM) con cellule T CD4⁺ che riconoscono specificamente l'epitopo della glicoproteina LCMV I-A^bGP_66-77, abbiamo descritto le procedure per accedere all'impegno precoce del destino delle cellule T_FH specifiche del virus sulla base di colorazioni con citometria a flusso. Inoltre, sfruttando la trasduzione retrovirale delle cellule T CD4⁺ SM, vengono forniti anche metodi per manipolare l'espressione genica nelle cellule_{T FH} virus-specifiche differenziate precocemente. Pertanto, questi metodi aiuteranno negli studi che esplorano i meccanismi alla base dell'impegno precoce delle cellule T_FH specifiche del virus.

Introduzione

Incontrando diversi agenti patogeni o minacce, le cellule T CD4⁺ naive adattano le loro risposte immunitarie differenziandosi in vari sottogruppi di cellule T helper (T_H) con funzioni specializzate¹. Nello scenario di infezione virale acuta, gran parte delle cellule T CD4⁺ naive si differenziano in cellule T helper follicolari (T_FH) che forniscono aiuto alle cellule B ^2,3. Distinte da altri sottogruppi di cellule T_H CD4⁺ (ad esempio, cellule T_H1, T_H2, T_H9 e T_H17), le cellule T

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti seguendo le procedure approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali della Terza Università Medica Militare. Nel presente studio sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topo: topo C57BL/6J (B6) (entrambi i sessi), di età compresa tra 6 e 8 settimane, del peso di 25-30 g; Topo transgenico CD45.1⁺SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenico), entrambi i sessi, di età compresa tra 6 e 8 settimane, del peso di 25-30 g; e topo transgenico CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenico × CXCR5-GFP knock-in), entrambi i sessi, di età compresa tra 6 e 8 settimane, del pe....

Discussione

La ricerca nel campo delle cellule T_FH è stata evidenziata sin dalla scoperta della funzione specializzata delle cellule T_FH nell'aiutare le cellule B. Studi accumulati hanno indicato che la differenziazione delle cellule T_FH è un processo multistadio e multifattoriale³⁰, in cui l'impegno del destino delle cellule T_FH è determinato nella fase iniziale⁵. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi alla base delle cellule .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700