Smussatura a umido degli aghi per microiniezione che utilizza una pressione dell'aria costante per un feedback sull'apertura dell'ago

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'assemblaggio di un sistema pneumatico per l'erogazione di aria pressurizzata a un ago durante il processo di smussatura dell'ago. Il protocollo descrive ulteriormente il processo di smussatura per la creazione di aghi per microiniezione affilati e come misurare la dimensione relativa dell'apertura dell'ago.

Abstract

Gli aghi per microiniezione sono uno strumento fondamentale per la somministrazione di reagenti per la modificazione del genoma, componenti CRISPR (RNA guida, proteina Cas9 e modello del donatore) e componenti del sistema di trasposoni (plasmidi e mRNA della trasposasi) in embrioni di insetti in via di sviluppo. Gli aghi affilati per microiniezione sono particolarmente importanti durante la somministrazione di questi agenti modificanti poiché aiutano a ridurre al minimo i danni all'embrione che viene iniettato, aumentando così la sopravvivenza di questi embrioni rispetto all'iniezione con aghi non smussati. Inoltre, la smussatura degli aghi produce aghi che sono più coerenti da ago ad ago rispetto agli aghi aperti rompendo casualmente la punta dell'ago sfiorando la punta contro un oggetto (lato di un vetrino coprioggetti, la superficie dell'embrione da iniettare, ecc.). Il processo di smussatura a umido degli aghi per microiniezione con aria a pressione costante erogata all'ago consente alla persona che smussa l'ago di sapere quando l'ago è aperto (presenza di bolle) e fornisce anche un'indicazione relativa di quanto grande è stata creata un'apertura dell'ago. La dimensione relativa dell'apertura nell'ago può essere determinata regolando la pressione dell'aria erogata all'ago fino a raggiungere un equilibrio e le bolle smettono di fluire dalla punta dell'ago. Più bassa è la pressione alla quale viene raggiunto l'equilibrio, maggiore è la dimensione dell'ago; E viceversa, maggiore è la pressione, minore è la dimensione dell'ago.

Introduzione

La modificazione genetica degli insetti è un processo originariamente sviluppato in Drosophila da Rubin e Spradling e, nel corso degli anni, questo processo è stato modificato per creare modificazioni genetiche in^{altre specie.} Il processo si basa sulla consegna precisa di componenti di modifica microiniettati negli embrioni in una specifica finestra di tempo e luogo all'interno dell'embrione in via di sviluppo ^2,3,4. Gli aghi affilati per microiniezione sono uno strumento fondamentale nel processo di modificazione gene....

Protocollo

NOTA: Il protocollo descritto di seguito utilizza il Sutter BV-10 microcapillare smussato. Tuttavia, questo protocollo può essere modificato per l'uso con qualsiasi modello di microcapillare smussato.

1. Assemblaggio del regolatore, del manometro e del tubo di alimentazione dell'aria

1. Tagliare una sezione di tubo in uretano per il collegamento dall'alimentazione dell'aria alla base del regolatore (R; Sezione 1, Figura 1). La lunghezza di questa sezione dipenderà dalla distanza dall'alimentazione dell'aria al regolatore, che si troverà accanto alla smus....

Discussione

La modificazione genetica delle zanzare si basa su una microiniezione precisa dei materiali di modificazione (plasmidi, RNA guida o proteine) negli embrioni pre-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Fondamentali per questo processo sono gli aghi affilati che perforano facilmente l'embrione

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050