Costruzione di un modello ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare non a piccole cellule che imita la progressione della malattia e predice le attività farmacologiche

Riepilogo

Questo studio presenta un modello ortotopico di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) basato sull'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari di cellule fluorescenti A549-iRFP. Il modello ricapitola gli stadi clinici del NSCLC e risponde al cisplatino, secondo il monitoraggio dinamico in vivo della fluorescenza a lunghezza d'onda lunga.

Abstract

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è una malattia altamente letale con un microambiente tumorale complesso ed eterogeneo. Attualmente, i modelli animali comuni basati sull'inoculazione sottocutanea di sospensioni di cellule tumorali non ricapitolano il microambiente tumorale nel NSCLC. Qui descriviamo un modello murino ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare che impiega l'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari tridimensionali (MCS). In particolare, le cellule NSCLC umane fluorescenti (A549-iRFP) sono state coltivate in micropiastre a 96 pozzetti a basso attaccamento con collagene per 3 settimane per formare MCS, che sono state poi inoculate intercostalmente nel polmone sinistro di topi nudi atimici per stabilire il modello di cancro del polmone ortotopico.

Rispetto alla linea cellulare A549 originale, la MCS della linea cellulare A549-iRFP ha risposto in modo simile ai farmaci antitumorali. Il segnale fluorescente a lunga lunghezza d'onda delle cellule A549-iRFP era fortemente correlato con i marcatori comuni della crescita delle cellule tumorali, tra cui il volume degli sferoidi, la vitalità cellulare e il livello di proteine cellulari, consentendo così il monitoraggio dinamico della crescita del cancro in vivo mediante imaging fluorescente. Dopo l'inoculazione nei topi, lo xenotrapianto A549-iRFP MCS è progredito in modo affidabile attraverso fasi molto simili agli stadi clinici del NSCLC, tra cui l'espansione del tumore primario, l'emergere di tumori secondari vicini e le metastasi delle cellule tumorali al polmone destro controlaterale e agli organi remoti. Inoltre, il modello ha risposto al farmaco di riferimento contro il cancro del polmone, il cisplatino, con la tossicità prevista e una progressione del cancro più lenta. Pertanto, questo modello murino ortotopico di xenotrapianto di NSCLC servirebbe come piattaforma per ricapitolare la progressione della malattia e facilitare lo sviluppo di potenziali farmaci antitumorali.

Introduzione

Tra tutti i disturbi oncologici, il cancro ai polmoni non solo infligge la più alta perdita di vita, ma reclama anche il secondo numero più alto di nuovi pazienti ogni anno^{negli Stati Uniti}. Questa devastante malignità rappresenta un grave ostacolo nell'assistenza sanitaria moderna, che richiede una comprensione più profonda della sua intricata biologia e modalità terapeutiche più efficaci². Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta l'85% del carcinoma polmonare e tende a svilupparsi in tumori solidi³. Una delle principali sfide nel cancro del polmone è il microambiente tumo....

Protocollo

Lo studio sugli animali è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Pacifico (Protocolli animali 19R10 e 22R10). Per il presente studio sono stati utilizzati otto topi nudi amimici maschi di età compresa tra 5 e 6 settimane, del peso di 20-25 g, allevati con la dieta per roditori di riferimento e alloggiati in condizioni prive di agenti patogeni (SPF). Le gabbie, le lettiere e l'acqua potabile venivano sterilizzate in autoclave e cambiate regolarmente. Uno schema dell'inoculazione del tumore nei topi è mostrato nella Figura 1. Consultare la Tabella dei materiali<....

Discussione

La costruzione di A549-iRFP MCS è una procedura di laboratorio semplice e altamente riproducibile e può essere tradotta in formazione di MCS per più linee cellulari. La MCS generata con l'aiuto della centrifugazione e del collagene mostra una struttura più integra e solida-simile a quella del tumore entro 3-4 giorni. Questo metodo garantisce la formazione di robusti sferoidi che mantengono la loro struttura integrale per periodi prolungati, in genere 2-3 settimane o anche più a lungo fino a quando iniziano a emerger.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01