Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa

Riepilogo

Questo protocollo descrive le procedure per isolare nuclei di alta qualità da isole pancreatiche congelate di primati non umani per l'uso nel sequenziamento simultaneo di RNA a singolo nucleo e nel sequenziamento ATAC, preservando la frazione citosolica di massa per le analisi metabolomiche dagli stessi campioni.

Abstract

Una sfida negli studi che utilizzano tessuti raccolti da più coorti è evitare gli effetti batch quando ci si prepara per esperimenti multi-omici su larga scala, come il sequenziamento combinato dell'RNA a singola cellula e la metabolomica. Il metodo del presente studio utilizza isole pancreatiche congelate da primati fetali non umani raccolti nell'arco di due anni per l'input nel sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo e nei saggi di sequenziamento ATAC. La frazione citosolica generata durante l'estrazione nucleare è stata conservata per l'elettroforesi capillare a valle-spettrometria di massa e la successiva quantificazione dei metaboliti. Questo metodo consente l'analisi di massa dei metaboliti che contribuiscono al cambiamento dei paesaggi trascrittomici ed epigenomici in condizioni sperimentali. È applicabile a molti tipi di tessuto e massimizza la quantità di informazioni che possono essere estratte da campioni che non sono prontamente disponibili. Man mano che il contributo del metabolismo alla creazione dell'identità cellulare attraverso modifiche epigenetiche diventa più apprezzato, le tecniche che consentono di identificare il contributo dei metaboliti in specifici tipi di cellule sono tempestive e necessarie.

Introduzione

Le isole pancreatiche di Langerhans sono fondamentali per la gestione della tolleranza al glucosio per tutta la durata della vita. L'incapacità di regolare correttamente i livelli di glucosio nel sangue tramite l'ormone ipoglicemizzante, l'insulina o l'ormone che aumenta il glucosio, il glucagone, provoca il diabete mellito¹. I fattori di rischio modificabili per ridurre al minimo il rischio di diabete includono l'esercizio fisico e la dieta. Inoltre, sta diventando chiaro che la dieta materna durante la gravidanza ha anche un effetto sulla suscettibilità della prole al diabete in età adulta

Protocollo

Il prelievo delle isole è stato condotto in conformità con le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon National Primate Research Center (ONPRC) e dell'Oregon Health and Science University ed è stato approvato dall'ONPRC IACUC. L'ONPRC rispetta l'Animal Welfare Act e i regolamenti applicati dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso del laboratorio. Il protocollo qui contenuto è stato applicato alle isole di macachi fetali Rhesus che sono stati sottoposti a necroscopia il giorno gestazionale 145 (la gestazione ....

Discussione

Storicamente, i metodi di isolamento nucleare per il sequenziamento di RNA e ATAC a nucleo singolo hanno utilizzato tamponi contenenti detergenti incompatibili con la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), una tecnica comune utilizzata per la quantificazione dei metaboliti^16,17. L'attuale protocollo consente la combinazione di tecniche trascrittomiche e metabolomiche dalla stessa preparazione del campione utilizzan.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020