Raccolta, inclusione e coltura dei gangli della radice dorsale in dispositivi multicompartimentali per studiare le caratteristiche neuronali periferiche

Riepilogo

Questo protocollo fornisce una tecnica per raccogliere e coltivare il ganglio radicale dorsale (DRG) espiantato da ratti Sprague Dawley adulti in un dispositivo multicompartimentale (MC).

Abstract

La caratteristica neuronale periferica più comune del dolore è una soglia di stimolazione abbassata o ipersensibilità dei nervi terminali dai gangli della radice dorsale (DRG). Una delle cause proposte di questa ipersensibilità è associata all'interazione tra le cellule immunitarie nel tessuto periferico e i neuroni. I modelli in vitro hanno fornito conoscenze fondamentali per comprendere come questi meccanismi determinano l'ipersensibilità ai nocicettori. Tuttavia, i modelli in vitro devono affrontare la sfida di tradurre l'efficacia nell'uomo. Per affrontare questa sfida, è stato sviluppato un modello in vitro fisiologicamente e anatomicamente rilevante per la coltura di gangli della radice dorsale intatti (DRG) in tre compartimenti isolati in una piastra a 48 pozzetti. I DRG primari vengono raccolti da ratti Sprague Dawley adulti dopo l'eutanasia umana. Le radici nervose in eccesso vengono tagliate e il DRG viene tagliato in dimensioni appropriate per la coltura. I DRG vengono poi coltivati in idrogel naturali, consentendo una crescita robusta in tutti i compartimenti. Questo sistema multicompartimentale offre un isolamento anatomicamente rilevante dei corpi cellulari DRG dai neuriti, tipi di cellule fisiologicamente rilevanti e proprietà meccaniche per studiare le interazioni tra cellule neurali e immunitarie. Pertanto, questa piattaforma di coltura fornisce uno strumento prezioso per studiare le strategie di isolamento del trattamento, portando in ultima analisi a un migliore approccio di screening per la previsione del dolore.

Introduzione

Il dolore cronico è la principale causa di disabilità e perdita del lavoro a livello globale¹. Il dolore cronico colpisce circa il 20% degli adulti a livello globale e impone un onere sociale ed economico significativo², con costi totali stimati tra i 560 e i 635 miliardi di dollari ogni anno negli Stati Uniti³.

La principale caratteristica periferica esibita dai pazienti con dolore cronico è una soglia di stimolazione dei nervi abbassata, che porta il sistema nervoso ad essere più reattivo agli stimoli ^4,5. L'a....

Protocollo

La raccolta del DRG è stata eseguita in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Nebraska-Lincoln. Per lo studio sono state utilizzate femmine di ratti Sprague Dawley di 12 settimane (~250 g). I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Fabbricazione e assemblaggio di dispositivi multiscomparto

1. Progettazione assistita da computer e stampa 3D del dispositivo multiscomparto
   NOTA: Il dispositivo MC è costituito da tre compartimenti per l'isolamento dei corpi cellula....

Discussione

Questo protocollo delinea un metodo per raccogliere i DRG Sprague Dawley adulti e coltivarli in idrogel naturali 3D. A differenza di questo metodo, altri approcci alla raccolta di DRG da topi e ratti prevedono l'isolamento della colonna vertebrale. La colonna vertebrale asportata viene dimezzata e il midollo spinale viene rimosso per esporre i DRG 23,24,25. Il danno al midollo spinale limita l'afflusso di sangue, che colpisce i .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-00	For trimming and cutting DRG
10x DMEM	MilliporeSigma	D2429
1x PBS (autoclaved)	Prepared in lab		7.3 - 7.5 pH
24 well plates	VWR	82050-892	To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single use	BD	309657
48 well plates	Greiner Bio-One	677180
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	To hold media for trimming and cutting
Aluminium foil	Fisherbrand	01-213-104
B27 Plus 50x	ThermoFisher	17504044	For DRG media
Collagen type I	Ibidi	50205
Curved cup Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16221-14	For dissection
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools	11293-00	For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044	For DRG media
Form cure	Form Labs		curing agent
Form wash	Form Labs		To wash excess resins off MC
Glass bead sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Glass vials (8 mL)	DWK Life Sciences (Wheaton)	224724
GlutaMax	ThermoFisher	35050-061	For DRG media
HEPES (1M)	Millipore Sigma	H0887
High temp V2 resin	FormLabs	FLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium Salt	MilliporeSigma	53747	Used to make MAHA
Irgacure	MilliporeSigma	410896
Laminin	R&D Systems	344600501
Large blunt-nose scissors	Militex	EG5-26	For dissection
Large forceps (serrated tips)	Militex	9538797	For dissection
Large sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14010-15	For dissection
Low Retention pipette tips	Fisher Scientific	02-707-017	For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)	Prepared in lab	N/A	85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	556-NG-100	For DRG media
Neurobasal A Media	ThermoFisher	10888022	For DRG media
Parafilm	Bemis	PM996
Parafilm	Bemis	PM996
Penicillin/Streptomycin (PS)	EMD Millipore	516106	For DRG media
pH test strips	VWR International	BDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)	USA Scientific	1111-2021
Preform 3.23.1 software	Formslab		To upload STL file
Rat	Charles River
Resin 3D printer	Form Labs	Form 3L	3D printing MC device
Small sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14094-11	For dissection
Sodium bicarbonate	MilliporeSigma	S6014
Straight cup rongeur	Fine Science Tools	16004-16	For dissection
Straight edge spring scissors	Fine Science Tools	15024-10	For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)	Fisher Scientific	22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)	Celltreat	229747
Tiny spring scissors	World Precision Instruments	14003	For trimming and cutting DRG
UV lamp	Analytik Jena US		To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)