Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

Riepilogo

Abbiamo stabilito un saggio di riassemblaggio della luciferasi divisa per monitorare i contatti reticolo endoplasmatico-mitocondri nelle cellule vive. Utilizzando questo saggio, descriviamo un protocollo per misurare quantitativamente il livello di questi accoppiamenti inter-organelli in cellule HEK293T, in condizioni di trattamento chimico.

Abstract

I siti di contatto tra reticolo endoplasmatico (ER) e mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nella salute cellulare e nell'omeostasi, come la regolazione del Ca²⁺ e dell'omeostasi lipidica, la dinamica mitocondriale, la biogenesi degli autofagosomi e dei mitofagosomi e l'apoptosi. L'incapacità di mantenere un normale accoppiamento ER-mitocondriale è implicata in molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la paraplegia spastica ereditaria. È di notevole importanza esplorare come la disregolazione dei contatti ER-mitocondriale possa portare alla morte cellulare e se la riparazione di questi contatti al livello normale possa migliorare le condizioni neurodegenerative. Pertanto, saggi migliorati che misurano il livello di questi contatti potrebbero aiutare a illuminare i meccanismi patogenetici di queste malattie. In definitiva, la messa a punto di saggi semplici e affidabili faciliterà lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Qui descriviamo un saggio di split-luciferasi per misurare quantitativamente il livello di contatti ER-mitocondri nelle cellule vive. Questo test può essere utilizzato per studiare il ruolo fisiopatologico di questi contatti e per identificare i loro modulatori nello screening ad alto rendimento.

Introduzione

Le interazioni tra l'ER e i mitocondri sono vitali per l'omeostasi cellulare e la sopravvivenza 1,2,3,4. Prove precedenti indicano che qualsiasi tipo di interruzione o disregolazione nei siti di contatto ER-mitocondri può contribuire a diverse malattie neurodegenerative, metaboliche e cardiovascolari, nonché al cancro 5,6,7,8,9,10.

Protocollo

1. Mantenimento delle cellule e semina (Giorno 1)

1. Mantenere HEK293T cellule in terreni di coltura cellulare contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (in piastre di coltura da 100 mm) in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Prima di iniziare, controllare la confluenza della lastra osservandola al microscopio. Quando le cellule raggiungono circa l'80-90% di confluenza, prepararsi a seminare le cellule in una piastra di coltura a 6 pozzetti rimuovendo il terreno e lavando con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di ....

Discussione

Abbiamo utilizzato un saggio di riassemblaggio split-Renilla luciferasi 8 (split-Rluc assay) per quantificare il livello di accoppiamenti ER-mitocondri. In questo studio, abbiamo modificato il costrutto originale split-Rluc²⁴ generando un singolo vettore, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry, codificante ogni componente split-Rluc (MitoRluc^N e Rluc^C

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C