L'ablazione cellulare laser in larve di Drosophila intatte rivela la competizione sinaptica

Riepilogo

Questo protocollo dimostra l'ablazione laser di singoli neuroni in larve di Drosophila intatte. Il metodo consente di studiare l'effetto della riduzione della competizione tra i neuroni nel sistema nervoso in via di sviluppo.

Abstract

Il protocollo descrive l'ablazione di un singolo neurone con un sistema laser a 2 fotoni nel sistema nervoso centrale (SNC) di larve intatte di Drosophila melanogaster. Utilizzando questo metodo non invasivo, il sistema nervoso in via di sviluppo può essere manipolato in modo specifico per le cellule. L'interruzione dello sviluppo dei singoli neuroni in una rete può essere utilizzata per studiare come il sistema nervoso può compensare la perdita di input sinaptico. I singoli neuroni sono stati specificamente ablati nel sistema di fibre giganti di Drosophila, con particolare attenzione a due neuroni: la fibra gigante presinaptica (GF) e il motoneurone tergotrocanterale postsinaptico (TTMn). Il GF fa la sinapsi con il TTMn omolaterale, che è cruciale per la risposta di fuga. L'ablazione di uno dei GF nel cervello del terzo stadio, subito dopo che il GF inizia la crescita assonale, rimuove permanentemente la cellula durante lo sviluppo del SNC. Il GF rimanente reagisce al vicino assente e forma un terminale sinaptico ectopico al TTMn controlaterale. Questo terminale atipico, bilateralmente simmetrico, innerva entrambi i TTMn, come dimostrato dall'accoppiamento del colorante, e aziona entrambi i motoneuroni, come dimostrato da saggi elettrofisiologici. In sintesi, l'ablazione di un singolo interneurone dimostra la competizione sinaptica tra una coppia bilaterale di neuroni che può compensare la perdita di un neurone e ripristinare le normali risposte al circuito di fuga.

Introduzione

L'ablazione laser è uno strumento preferito per sezionare i circuiti neurali in un'ampia varietà di organismi. Sviluppato in sistemi genetici modello come vermi e mosche, è stato applicato in tutto il regno animale per studiare la struttura, la funzione e lo sviluppo del sistema nervoso ^1,2,3. Qui, l'ablazione di un singolo neurone è stata impiegata per studiare come i neuroni interagiscono durante l'assemblaggio del circuito in Drosophila. Il sistema di fuga della mosca è un circuito preferito per l'analisi perché contiene i neuroni più grandi e le sinapsi più grand....

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati per il protocollo erano della specie Drosophila melanogaster. Non ci sono problemi etici che circondano l'uso di questa specie. Per svolgere questo lavoro non è stato necessario un nulla osta etico. I dettagli delle specie di Drosophila , dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Allevamento di Drosophila e selezione dello stadio larvale corretto

1. Scegliere una linea driver Gal4 che guidi l'espressione nelle cellule che devono essere ablate e ricombinarla o attraversarla con una lin....

Discussione

L'ablazione cellulare con un microscopio a 2 fotoni si è dimostrata un metodo di grande successo per manipolare lo sviluppo del circuito neuronale in Drosophila. Poiché questo metodo non è invasivo, provoca danni minimi all'animale. I dati supportano l'utilità di questa manipolazione cellulo-specifica di circuiti noti.

Fondamentale per il successo dell'ablazione è stata la selezione del driver Gal4 più appropriato. Poiché il GFS è ben studiato, sono state descritte molte linee.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185