Breeding by Design per riso funzionale con tecnologie di editing genomico

Riepilogo

Il protocollo descrive l'allevamento di varietà di riso da amido resistenti utilizzando tecnologie di editing del genoma in modo preciso, efficiente e tecnicamente semplice.

Abstract

Gli approcci convenzionali alla selezione delle colture, che si basano prevalentemente su metodi dispendiosi in termini di tempo e manodopera come l'ibridazione tradizionale e la selezione per mutazione, incontrano sfide nell'introdurre in modo efficiente tratti mirati e generare popolazioni vegetali diversificate. Al contrario, l'emergere delle tecnologie di editing del genoma ha inaugurato un cambiamento di paradigma, consentendo la manipolazione precisa e rapida dei genomi delle piante per introdurre intenzionalmente le caratteristiche desiderate. Uno degli strumenti di editing più diffusi è il sistema CRISPR/Cas, che è stato utilizzato dai ricercatori per studiare importanti problemi legati alla biologia. Tuttavia, il flusso di lavoro preciso ed efficace dell'editing del genoma non è stato ben definito nella selezione delle colture. In questo studio, abbiamo dimostrato l'intero processo di selezione di varietà di riso arricchite con alti livelli di amido resistente (RS), un tratto funzionale che svolge un ruolo cruciale nella prevenzione di malattie come il diabete e l'obesità. Il flusso di lavoro comprendeva diverse fasi chiave, come la selezione del gene SBEIIb funzionale, la progettazione dell'RNA a guida singola (sgRNA), la selezione di un vettore di editing genomico appropriato, la determinazione del metodo di consegna del vettore, la conduzione della coltura di tessuti vegetali, la genotipizzazione della mutazione e l'analisi fenotipica. Inoltre, è stato chiaramente dimostrato il lasso di tempo necessario per ogni fase del processo. Questo protocollo non solo semplifica il processo di selezione, ma migliora anche l'accuratezza e l'efficienza dell'introduzione dei caratteri, accelerando così lo sviluppo di varietà di riso funzionali.

Introduzione

L'allevamento tradizionale si basa sull'introduzione di tratti nelle colture o sulla produzione di popolazioni vegetali con una variazione sufficiente, il che richiede un'osservazione sul campo a lungo termine ^1,2. A causa dei limiti dell'allevamento tradizionale, è stata sviluppata una tecnologia di editing genetico, in grado di modificare con precisione il genoma delle colture per ottenere i tratti desiderati delle popolazioni vegetali³. Il sistema di editing genetico più utilizzato nelle piante è CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Pali....

Protocollo

Lo studio è stato condotto presso la Bellagen Biotechnology Co. Ltd in Cina seguendo le linee guida del comitato etico per la ricerca umana. Prima di partecipare, il protocollo di studio è stato spiegato in modo approfondito ai soggetti, che hanno fornito il consenso informato.

1. Progettazione di sgRNA e vettore di costruzione (tempistica 5-7 giorni)

NOTA: Un vettore binario è stato utilizzato per esprimere il sistema CRISPR/Cas-SF01²¹. Non avere meno di 3 nucleotidi (nt) in discrepanza con un potenziale sito fuori bersaglio per l'sgRNA. L'....

Discussione

Nel processo di costruzione di vettori di knockdown basati su CRISPR/Cas-SF01, la selezione meticolosa di RNA a guida singola (sgRNA) è fondamentale. Ciò richiede l'adozione di sequenze che mostrino un'elevata efficienza di editing con effetti fuori bersaglio minimi. Inoltre, la sintesi dei primer di targeting incorpora brevi oligo adattatori che corrispondono ai siti di splicing del vettore, garantendo un'integrazione senza soluzione di continuità. In particolare, a differenza delle .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium