Raccolta di sangue dal Granchio Ferro di Cavallo Americano, Limulus Polifemo

Riepilogo

Il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus polyphemus, è probabilmente la fonte più conveniente per grandi quantità di sangue di qualsiasi invertebrati. Il sangue è semplice nella composizione, con un solo tipo cellulare nella circolazione generale, il Amebocyte granulare, e solo tre proteine ​​abbondanti nel plasma, hemocyanin, il C-reattiva proteine, e α2-macroglobulina. Il sangue viene raccolto dal cuore e le cellule del sangue e del plasma sono separate per centrifugazione.

Abstract

Il granchio a ferro di cavallo è il miglior sistema caratterizzato immune di lunga durata invertebrati. Lo studio di immunità in granchi a ferro di cavallo è stata agevolata dalla facilità nella raccolta di grandi volumi di sangue e dalla semplicità del sangue. Granchi a ferro di cavallo mostrano solo un unico tipo di cellule nella circolazione generale, il Amebocyte granulare. Il plasma è il contenuto di sale dell'acqua di mare e solo tre proteine ​​abbondanti, hemocyanin, la proteina respiratoria, il C-reattiva proteine, che funzionano nella distruzione citolitica di cellule estranee, comprese le cellule batteriche, e α2-macroglobulina, che inibisce la proteasi di patogeni. Il sangue viene raccolto da diretto puntura cardiaca in condizioni che riducono al minimo la contaminazione da lipopolisaccaride (aka, endotossina, LPS), un prodotto di batteri Gram-negativi. Un animale di grandi dimensioni può produrre 200-400 ml di sangue. Per lo studio del plasma, le cellule del sangue vengono immediatamente eliminati dal plasma per centrifugazione e il plasma può essere frazionato nelle sue proteine ​​costituenti. Le cellule del sangue sono opportunamente studiate al microscopio attraverso la raccolta di piccoli volumi di sangue in LPS-free soluzione salina isotonica (0,5 M NaCl) in condizioni che consentono l'esame microscopico diretto mettendo uno dei più LPS-free vetrini sulla superficie del piatto di cultura, poi quelli di montaggio vetrini nelle camere di semplice osservazione a seguito dell'adesione cellulare. Una seconda preparazione per l'osservazione diretta è quella di raccogliere 3 - 5 ml di sangue in una LPS-free piatto embrione e poi espianto frammenti di amebociti aggregati ad una camera che il tessuto sandwich tra una diapositiva e il coprioggetti. In questa preparazione, il amebociti mobili migrare sulla superficie coprioggetti, dove possono essere prontamente rilevate. Il sistema di coagulazione del sangue comporta l'aggregazione di amebociti e la formazione di un coagulo extracellulare di una proteina, coagulin, che viene rilasciata dai granuli secretori delle cellule del sangue. Analisi biochimica delle cellule del sangue lavate richiede che l'aggregazione e la degranulazione non si verifica, che può essere realizzato attraverso la raccolta di sangue in 0,1 volumi pari al 2% Tween-20, 0,5 M NaCl LPS-free, seguita da centrifugazione delle cellule e lavaggio con 0,5 M NaCl.

Protocollo

Caratteristiche anatomiche del granchio a ferro di cavallo rilevanti per sanguinamento (Fig. 1)

Figura 1

1. Le tre divisioni principali del corpo, da anteriore a posteriore, sono i Prosoma (P), il opisthosoma (O), e il telson (T) ^1.
2. I margini anteriore e laterale libera del Prosoma è la flangia.
3. Il posteriore-la maggior parte rientro del opisthosoma, dove il telson articola, è la baia terminale.
4. Il comune dove l'Prosoma e il opisthosoma articolato è il perno (H).
5. Il cuore si trova lungo la linea mediana dorsale, appena sotto il carapace di prostoma e opisthosoma ² (Fig. 2).
   
   
   
   
   Figura 2
   
   

Considerazioni generali, la sterilità e la protezione dall'esposizione al lipopolisaccaride (endotossina)

1. Il nemico principale della sanguinare successo è aggregazione cellulare, esocitosi, e la formazione del coagulo coagulin. L'aggregazione delle cellule e esocitosi sono stimolati dal lipopolisaccaride (aka, endotossina, LPS), un prodotto di batteri Gram-negativi. La concentrazione soglia di LPS per esocitosi per le cellule lavate è di 0,1 - 1 mg / mL, ma le cellule sospese nel plasma sono attivati ​​da concentrazioni significativamente più basse ^3. Endotossina non è inattivato in autoclave semplice e può essere assunto ad essere presenti sulle superfici e nelle soluzioni e reagenti che non sono certificati per essere privo di endotossine.
2. Per ridurre le probabilità di coagulazione durante la raccolta del sangue, selezionare solo perfetto, gli animali intatti per il sanguinamento. Pre-chill gli animali 1-2 ore nella 4 ° C in camera. Pratica tecnica sterile. Evitare la contaminazione con endotossine.
3. LPS-free soluzione salina al 3% è utilizzato in medicina clinica e può essere acquistato da fornitori medica (vedi tabella dei reagenti specializzata e forniture). LPS può essere rimosso dal vetro e metallo con incubazione a 180 ° C per 4 ore. Sterili monouso aghi da siringa, Petri piatti in stile cultura, e con tappo a vite provette sono tutte LPS-free e può essere utilizzato senza modifiche, purché corretta tecnica sterile è praticata.
4. La stabilità delle cellule del sangue di diversi animali è diverso, con le cellule di alcuni singoli animali sottoposti a degranulazione spontanea, causando la formazione del coagulo coagulin, anche quando l'animale è dissanguato con la massima cura. Le cellule del sangue di altri granchi a ferro di cavallo individuali sono molto più stabili e, quando le procedure adeguate sono seguite, rimangono completamente granulare durante il dissanguamento e la separazione di cellule dal plasma.
5. Diversi agenti sono stati segnalati per stabilizzare le cellule del sangue a seguito di sanguinamento, tra cui la caffeina (sbavature 0,25 volumi di 10 mM caffeina in LPS-free NaCl 3%) ^4, propranololo (1 concentrazione mM finale) ^5, dimetilsolfossido ^6, chelazione catione bivalente ( sanguinare in un uguale volume di 0,1 M destrosio, 0,03 M citrato di sodio, 0,026 M di acido citrico, 10 mM sodio etilendiamminotetraacetico acido (Na ₂ EDTA), pH 4.6) ^7, gli inibitori della proteina G e la fosfolipasi C-vie (colera e tossine pertussus, U73122) ^8, la sostituzione di cloruro di anione isetionato ^9, bloccanti dei canali del cloruro ^9, AMP ciclico-antagonisti ^9, reagenti sulfidrilici (5 mM N-etil maleimmide, NEM) ^5, e la membrana attiva detergente Tween-20 ( sbavature 0,1 volume 2% Tween-20 in LPS-free 0,5 M NaCl).

Materiali di consumo e reagenti per sanguinamento del granchio a ferro di cavallo: raccolta di grandi volumi di sangue

1. uno o più grandi, granchio a ferro di cavallo intatto
2. spruzzatore contenente etanolo al 70%
3. Kimwipes
4. 14 gauge
5. forcipe robusto
6. secchiello per il ghiaccio con ghiaccio
7. 50 mL con tappo a vite in plastica provette monouso
8. rack per tenere i 50 mL
9. centrifuga da banco
10. sterile 50 ml pipette sierologiche
11. bulbo di tipo pipetta filler
12. apparato filtro sterile monouso
13. pompa da vuoto
14. LPS-free soluzione al 3% di NaCl (per la raccolta delle cellule del sangue)
15. Tween-20 (per la raccolta delle cellule del sangue)

I preparativi per i grandi volumi di sanguinamento

1. Per sanguinamento, uso di grandi dimensioni, gli animali non danneggiato. Freddo l'animale per 1 h in una stanza fredda prima di sanguinamento.
2. Stabilire una sistemazione confortevole con un supporto stabile per un secchio di ghiaccio che è di circa 0,3 metri di altezza (l'usa e getta contenitore di polistirolo per l'invio reagenti freddi o congelati è appropriato) e una sedia bassa per l'operatore. Il secchiello del ghiaccio è posta sulla struttura di supporto e la sedia è disegnatafino a questa unità. Si dovrebbe essere seduta comoda per un lungo periodo sulla sedia con i gomiti appoggiati sulle cosce, e con la mano sinistra in possesso di un granchio a ferro di cavallo che lotta posizionato sopra provette di raccolta del sangue in posizione verticale appoggiato su un letto di ghiaccio nel secchiello del ghiaccio.
3. Pre-chill 4-6 dei 50 tubi di plastica usa e getta centrifuga ml con tappi a vite in bagno di ghiaccio. I tubi sono in posizione verticale nel ghiaccio disposti intorno al perimetro del contenitore bagno di ghiaccio. Poco prima di iniziare l'operazione sanguinamento, rimuovere i tappi dai tubi e tappi posto sul tavolo accanto, aderendo alla tecnica sterile.
4. Togliere il tappo di un ago 14 ga e usare il forcipe robusto per allentare l'ago nella sua manica, ma non rimuovere l'ago dalla manica. Mantenere la sterilità. NON TOCCARE QUALSIASI PARTE DEL AGO con le dita. Manicotto posto con l'ago su un bancone adiacente con il calcio esposta dell'ago elevata da contatto con una superficie di mantenere la sua sterilità.
5. Inumidire un Kimwipe con il 70% di etanolo.

Sanguinamento l'animale (in particolare per la mano destra dell'operatore)

1. Tenendo l'animale per emorragia: animale afferrare con la mano sinistra con le quattro dita a contatto con la flangia anteriore del Prosoma il pollice e afferrare la parte posteriore del opisthosma alla base della coda (la baia terminale). La superficie ventrale dell'animale si affaccia sul palmo della mano. Telson si trova lungo la base del pollice e progetti per il polso. Flex l'animale delicatamente in modo che Prosoma e opisthosoma sono ad angolo retto l'uno all'altro (Figura 3a).
   
   
   
   Figura 3
   
   
2. Pulire il esposti Prosoma comune cerniera di collegamento e opisthosoma con etanolo al 70% applicata con un etanolo inumidito Kimwipe (Figura 3b).
3. Ruotare la mano sinistra in modo che le dita 2-4 sono più in alto e la superficie dorsale dell'animale rivolto verso l'alto. Con la mano destra, inserire la siringa 14 ga ago, ancora nella sua custodia protettiva, tra le dita 2 e 3 della mano sinistra. Prendete la pinza nella mano destra e rimuovere l'ago dalla custodia protettiva afferrando l'estremità con la pinza (Figura 3c). Ruotare la mano sinistra in modo che la superficie dorsale della mano volti alla vostra sinistra, pollice e l'indice sono, e l'animale è a testa in giù, con la sua superficie dorsale di fronte alla mano destra. Posizionare il calcio dell'ago sopra il primo dei tubi da 50 ml di raccolta e orientare il animale in modo che la punta dell'ago è puntato la cerniera in modo congiunto e che l'albero ago è parallela alla linea mediana dorsale (Figura 3d). Inserire la punta dell'ago attraverso l'articolazione a cerniera nel lume del cuore, mantenendo l'ago posizionato parallelamente alla linea mediana dorsale e inserito sulla linea mediana e con il calcio del l'ago ancora posizionato sopra l'apertura del tubo di raccolta. L'ago viene inserito di circa 1 - 2 cm in profondità nella parte del cuore nel Prosoma. Non appena il cuore è forato, il sangue scorrerà rapidamente (Figura 4a, freccia), per cui è importante assicurare che alla fine consegna l'ago della siringa è posizionato sopra la bocca del tubo di raccolta a raccogliere tali ondata iniziale di sangue.
4. Il sangue esce dal cuore inizialmente in un flusso continuo che, dopo circa 30 - 50 mL di sangue sono stati raccolti, sarà lento singole gocce (Fig. 4b). Per migliorare il flusso di sangue, può essere una buona politica di ri-orientare la punta dell'ago leggermente. Inclinare l'ago in alto o in basso, a sinistra oa destra, far scorrere la sua punta più in profondità nel cuore e non tirarlo per più vicino alla cerniera comune per trovare la posizione che ottimizza il flusso di sangue. Non comprimere eccessivamente l'animale, perché questo rischia di danneggiare l'animale e può causare il sangue travasato di avviare la coagulazione.
   
   
   
   Figura 4
   
   
5. Come ogni provetta si riempie di sangue, ruotare il bagno di ghiaccio per portare il tubo sotto vuoto accanto alla fine consegna del ago.
6. Come sanguinamento rallenta, si corre il rischio di avere il flusso d'aria in una direzione retrograda in ago e nel cuore. Ciò può verificarsi quando l'animale si raddrizza, riducendo così la pressione sanguigna. Cercare di prevenire questo, mantenendo l'animale in posizione flessa o consentendo raddrizzamento a verificarsi solo lentamente.
7. Quando l'animale smette di donare il sangue, rimuovere l'ago sanguinante dal cuore. Richiudere la raccolta tubi e centrifugare immediatamente nel tavolo centrifuga, 1000 RPM, 5 min. Le cellule del sangue si forma pellet compatta al fondo dei tubi di raccolta. Poiché tutti i componenti per la coagulazione del sangue sono contenute all'interno di vescicole secretorie delle cellule del sangue, appena al plasma è separato dalle cellule,il rischio di coagulazione del plasma viene eliminato.
8. E 'indispensabile per evitare la coagulazione del sangue uscito dai vasi. Le seguenti misure riducono il rischio di coagulazione: Pre-agghiacciante l'animale e il mantenimento dei tubi di raccolta in un bagno di ghiaccio; gentile manipolazione degli animali; riduzione della rapidità con cui il sangue scorre fuori l'ago della siringa; centrifugazione del sangue subito dopo la raccolta, per evitare l'inquinamento di aghi e tubi di raccolta con endotossina; mantenimento della procedura sterile. Come è stato già detto, alcuni singoli animali hanno cellule del sangue particolarmente irritabile che avviano esocitosi, anche quando queste precauzioni sono seguite.
9. Dopo la centrifugazione, ispezionare i tubi per i segni di coagulazione del sangue - fili di cellule e materiale coagulo gelatinoso attaccato alle pareti del tubo, materiale gelatinoso al vertice del coagulo, o, peggio, di grandi quantità di coaguli di sangue con cellule intrappolate nella fluido della colonna (figura 4c, freccia). Il materiale da questi tubi non è siero, plasma, e contiene i prodotti secreti delle cellule del sangue.
10. Trasferire il plasma in provette sterili da 50 ml con la pipetta sterile sierologici. Prestare attenzione durante il pipettaggio per evitare aspirare qualsiasi delle cellule del pellet cellulare nel fondo della provetta. E 'meglio lasciare pochi ml di plasma al di sopra del pellet per non disturbare il pellet.
11. La procedura sopra descritta è progettato per raccogliere grandi quantità di plasma incontaminato dai prodotti di secrezione delle cellule del sangue. Per raccogliere grandi quantità di cellule del sangue lavate, raccogliere il sangue in 0,1 volumi pari al 2% Tween-20 dissolto nel 3% LPS senza soluzione di NaCl. Centrifugare le cellule dolcemente per 10 minuti per stabilire un allentato pellet cellulare, poi lavare le cellule con diversi cambiamenti di LPS-free NaCl 3%. Un estratto delle cellule che contiene i prodotti di secrezione delle cellule del sangue possono essere preparati da lisi delle cellule lavate in LPS senza acqua distillata. Questo lisato contiene una gamma diversificata di proteine ​​e peptidi che operano in antimicrobico difese immunitarie ^10,11 e contiene anche coagulogen, la forma zimogeno della proteina strutturale del coagulo di sangue extracellulare, e la raccolta delle proteasi che convertono coagulogen a coagulin, la forma della proteina che polimerizza in fibrille dei ¹² coagulo. Il brano è stato simile a quello prodotto in commercio, Limulus Amebocyte lisato o LAL, che viene utilizzato per test per la presenza di lipopolisaccaride ^13. La cascata delle proteasi responsabili della modificazione proteolitica dei coagulogen a coagulin è attivato da LPS ^14.
12. Disposizione degli animali dopo il dissanguamento. Sanguinamento condotta con i metodi di cui sopra è ben tollerato dall'animale. Quando si lavora al Marine Biological Laboratory di Woods Hole, ritorno degli animali al mare dopo emorragia con l'aspettativa che sopravviveranno. Se gli animali sono mantenuti in acquari distanti dalla normale gamma di granchi a ferro di cavallo, possono essere dissanguati ripetutamente una o due volte al mese. Come viene descritto di seguito, gli animali in cattività richiedono acqua di alta qualità e poppate frequenti per mantenere la loro salute. L'eutanasia può essere compiuta con la distruzione del ganglio dorsale, che si trova sulla linea mediana dorsale tra gli occhi.

Lavorazione e stoccaggio del plasma

1. Protezione dalle proteasi. Se il plasma deve essere usato per la purificazione di proteine, che devono essere trattati con inibitori della proteasi immediatamente dopo la raccolta. Aggiungi phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) ad una concentrazione finale di 1 mm. PMSF è conservato come una soluzione 0,1 M magazzino in DMSO o etanolo. E 'abbastanza instabile in acqua ^15, quindi non può essere invocata per la protezione duratura, ma oltre subito dopo la separazione del plasma dal sangue le cellule inattivare il piccole quantità di proteasi che avrebbe potuto essere rilasciato dalle cellule.
2. Filtrazione sterile: sterilizzare il plasma da ultrafiltrazione sotto vuoto usando una usa e getta medie filtrazione dispositivo dotato di un filtro di 0,22 millimetri pori. Questi filtri hanno la tendenza a intasare. Si consiglia di centrifugare il plasma prima di filtraggio per ridurre questo problema. Se grandi volumi di plasma vengono trattati, si consiglia di pre-filtro del plasma prima con un filtro Millipore con una dimensione di 1 millimetro pori, poi con un 0,45 millimetri diametro dei pori del filtro Millipore.
3. Plasma può essere protetta dalla contaminazione batterica o aggiungendo NaN ₃ a una concentrazione finale di 0,2 mg / ml o mediante filtrazione sterile. Non sterile al plasma non dovrebbe mai essere conservati per periodi più lunghi di 2 giorni senza uno o l'altro di questi anti-batteriche misure adottate.
4. Coagulazione del sangue. A differenza del sistema di coagulazione dei mammiferi, il plasma Limulus contiene nessuno degli elementi per la coagulazione del sangue. Invece, l'intera macchina per la formazione del coagulo, la proteina strutturale del coagulo (coagulogen) e il sistema delle proteasi quel processo coagulogen per renderlo in grado di polimerizzazione in coagulo insolubile, si trova nei granuli secretori delle cellule del sangue ^16. Quindi, se le cellule del sangue vengono rimossi prima che abbiano la possibilità di sottoporsi esocitosi, il plasma è completamente privo di proteine ​​per la coagulazione e resterà fluido a tempo indeterminato.
5. Proteine ​​di purificazione. Hemocyanin è presente a 40 mg / ml nel plasma ed è un 48-mer di una subunità 70 kDa. Può essere isolato da ultracentrifugazione (40.000 X g, 8 h) o gel filtrazione con un grande resina esclusione dimensione dei pori, come Biogel A5M ^17. Il C-reattiva proteine ​​sono presenti a 1 - 5 mg / ml e può essere isolato da un isolamento affinità su phosphorylethanolamine-Sepharose, con eluizione con un chelante del calcio ^18. L'ampio spettro inibitore della proteasi, un _{2-macroglogulin,} è stato purificato da gel filtrazione su Sephacryl S-300 in resina dopo hemocyanin e la C-reattiva, le proteine ​​sono stati rimossi ^19.

L'esame al microscopio delle cellule del sangue mobili in cultura

1. Istituzione di prati Amebocyte in vitro: LPS-free soluzione al 3% di NaCl viene aggiunto Petri sterile in plastica, piatti in stile cultura (1 mL per un piatto di 35 mm, 2,5 ml per un piatto 60 mm, 6 ml per un piatto 90 mL). Il sangue viene poi ottenuto mediante puntura cardiaca con il metodo descritto sopra, ma con la modifica che un 23 gauge, 1 ago della siringa sterile viene usato al posto di l'ago calibro 14. Sangue scorre goccia a goccia da l'ago 23 gauge e 1 goccia viene raccolta nel piatto 35 mm, 3 gocce nel piatto 60 mm e 9 gocce nel piatto 100 mm. Le cellule del sangue vengono poi mescolati in modo uniforme alla soluzione al 3% di NaCl da dolci vorticoso, prima in un modello circolare, poi di nuovo-e-via. La preparazione è incubata per 5 minuti a T ambiente per permettere cellule del sangue di attaccarsi alla superficie piatto, allora la soluzione salina iniziale viene sostituito con un buffer di scelta ^3.
2. Se si desidera mantenere il substrato-attached cellule del sangue in una condizione undegranulated, l'iniziale salso-sangue misto plasma viene sostituito con LPS-free freschi 3% di NaCl. Plasma accelera la degranulazione spontanea delle cellule del sangue anche in assenza di LPS, e la sua rimozione stabilizza lo stato undegranulated delle cellule.
3. Se la soluzione salina iniziale viene sostituito con plasma sterile, le cellule del sangue trasformare dalla forma ovoidale delle cellule del sangue circolante (Fig. 5) e appiattire sul substrato, e quindi avviare degranulazione e la formazione di uno strato di extracellulare coagulo di sangue coagulin sopra il prato di amebociti appiattita ^20.
   
   
   
   Figura 5
   
   
4. Istituzione di culture espianto di amebociti aggregati. Quando il sangue viene raccolto in sterile, LPS senza condizioni, le cellule del sangue si sistemerà da sospensione e aggregati per formare un tessuto-come la massa. Un contenitore conveniente per questo è il piatto di vetro embrione reso LPS-free di incubazione per 4 ore a 180 ⁰ C. Sangue raccolto in questo contenitore mediante puntura cardiaca con un 19 gauge è incubato per 1 - 2 ore a T ambiente, poi i pezzi vengono tagliati 1 mm quadrati dal aggregato Amebocyte con una sterile 18 gauge siringa e sono inserito tra due vetrini o un coprioggetti e una diapositiva separati da frammenti di vetrini per fungere da distanziatori. Dopo circa mezz'ora, amebociti iniziare la migrazione dalla periferia del espianto sul coprioggetti (Fig. 6a), dove possono essere visti con contrasto di fase o ottica DIC ^21. Inizialmente, le cellule migrano sono compatti con ialino pseudopodi (Fig. 6b (m)) che si estendono al di sopra del substrato di migrazione, e che poi si abbassano in contatto con la superficie e in avanti il movimento coinvolge il flusso del citoplasma granulare nel pseudopodio ²² . Successivamente, le cellule appiattire (Fig. 6b (f)) e avviare degranulazione (Fig. 6b (d)) e cessare locomozione ^23. La camera di cultura qui descritto consente la perfusione di diversi agenti sperimentali nella camera di cultura per studiare i loro effetti sulla motilità cellulare e l'esocitosi dei granuli ^9. Un'ampia revisione metodologica della cultura Amebocyte per l'esame microscopico può essere trovato in ^24.
   
   
   
   Figura 6
   
   

Manutenzione degli adulti granchi a ferro di cavallo negli acquari

Granchi a ferro di cavallo richiedono acqua ad alta qualità del mare e possono essere mantenuti in acquari dotati di un sistema di depurazione dell'acqua che fornisce la filtrazione delle particelle, aerazione, e denitrificazione delle acque ^25. Gli animali devono essere alimentati a 2 o 3 volte a settimana su gamberi, aragoste, pesce o calamari. L'alimentazione si ottiene eliminando l'animale da acquario, plaziamento sul suo dorso, e ponendo il cibo in bocca. Se ha fame, l'animale inizierà presto deglutire il cibo. A seconda della sofisticazione del sistema di acqua di mare, l'animale deve essere mantenuta per circa un'ora fino a che non defeca in un contenitore separato di acqua di mare o può essere restituito al acquario dopo l'alimentazione è iniziato. Per la manutenzione a lungo termine, l'animale deve essere tenuto lontano dalla luce per evitare la crescita di alghe verdi o blu-verde sulla superficie del carapace. Alghe erodere il carapace e dal momento che l'adulto non muta, questo causerà la morte per l'animale ^26. In natura, gli animali che trascorrono gran parte del tempo parzialmente sepolto nella sabbia, ma la sabbia o ghiaia in acquario presenta una difficoltà a mantenere il livello di pulizia importanti per la manutenzione a lungo termine.

Discussione

Ci sono quattro specie di granchio a ferro di cavallo, Polifemo Limulus dalla costa orientale del Nord America e tre le specie che spaziano dal Giappone al Golfo del Bengala. L'animale è identificato come un "fossile vivente", perché le forme anatomicamente simili sono stati trovati come fossili da 445 milioni di anni fa ^27. Il granchio a ferro di cavallo rappresenta un longevo animale, che richiede 10 - 13 anni per raggiungere la maturità e la vita almeno 20 anni ^28. Anche se è stato sottopo...