Analisi dell'RNA di campioni ambientali mediante RT-PCR
Panoramica
Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz
La reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) coinvolge lo stesso processo della PCR convenzionale : temperatura ciclica per amplificare gli acidi nucleici. Tuttavia, mentre la PCR convenzionale amplifica solo gli acidi desossiribonucleici (DNA), la RT-PCR consente l'amplificazione degli acidi ribonucleici (RNA) attraverso la formazione di DNA complementare (cDNA). Ciò consente di analizzare gli organismi a base di RNA trovati nell'ambiente utilizzando metodi e tecnologie progettati per il DNA.
Molti virus presenti nell'ambiente usano l'RNA come materiale genetico. Diversi patogeni virali a base di RNA, come il Norovirus,e organismi indicatori, come il virus della chiazze lievi del pepe (PMMoV), non hanno metodi di rilevamento basati sulla coltura per la quantificazione. Al fine di rilevare la presenza di questi virus a RNA in campioni ambientali provenienti da suolo, acqua, agricoltura, ecc.,I saggi molecolari si basano sulla RT-PCR per convertire l'RNA in DNA. Senza RT-PCR, i microbiologi non sarebbero in grado di saggiare e ricercare numerosi virus a base di RNA che presentano rischi per la salute umana e ambientale.
La RT-PCR può anche essere impiegata come strumento per misurare l'attività microbica nell'ambiente. L'RNA messaggero (mRNA) è il modello a singolo filamento per la traduzione delle proteine e la misurazione dei livelli di diversi mRNA indica quali geni da cui i microbi vengono espressi nell'ambiente. L'analisi dell'espressione genica fornisce indizi su quali percorsi biologici vengono utilizzati dagli organismi per sopravvivere in diverse condizioni ambientali. In alcuni casi, l'espressione genica può essere utilizzata per determinare quali organismi possono sopravvivere meglio in condizioni difficili e hanno capacità di biorisanamento del suolo o dell'acqua contaminati.
Procedura
1. Raccolta del campione: campione di terreno
- Trova una posizione di esempio tramite GPS, coordinate o vista.
- Per il campionamento casuale, scegli punti casuali all'interno di un'area per ottenere un censimento generale degli habitat microbici. Il campionamento del transetto raccoglie da punti lungo una linea retta, ad esempio, adiacenti a un letto di torrente. I campioni della griglia vengono prelevati sistematicamente da punti a intervalli regolari e sono utili per mappare le comunità micro
Risultati
Quando rt-PCR è completa, parte del prodotto PCR può essere separato e visualizzato su un gel di acarosio (Figura 3). In questo esempio, è stato utilizzato un primer gene-specifico per rilevare la presenza di un virus a RNA. Bande della dimensione prevista sono ottenute da due dei campioni e dalla reazione di controllo positiva, ma non dal controllo negativo, indicando la presenza di questo virus in due dei campioni di acqua sottoposti a test.
Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
Applicazione e Riepilogo
RT-PCR è necessario per creare cDNA da un modello di RNA. Ciò consente di analizzare i microrganismi a base di RNA utilizzando saggi molecolari sviluppati per il DNA. Una volta sintetizzato il cDNA, i saggi PCR possono determinare la presenza o l'assenza di microrganismi a base di RNA all'interno di un campione ambientale. Ciò consente ulteriori analisi a valle per determinare l'ecologia microbica, i rischi per la salute e i rischi ambientali.
RT-PCR può anche essere utilizzato per saggiare l'mRNA come mezzo per osservare quali ge...
Personale delle biblioteche
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati