La seguente procedura fornisce i passaggi dettagliati necessari per raccogliere immagini NIRF in vivo ed ex vivo da piccoli animali:

1. Configurazione sperimentale

1. Collegare una sorgente luminosa in fibra ottica al sistema di imaging a fluorescenza utilizzando una guida luminosa in fibra ottica.
2. Selezionare il filtro di eccitazione appropriato per l'esperimento. Il filtro di eccitazione determina la lunghezza d'onda della luce da consegnare al campione e deve essere scelto per corrispondere allo spettro di eccitazione del fluoroforo introdotto nel campione.
3. Selezionare il filtro di emissione appropriato. Il filtro di emissione blocca i componenti spettrali indesiderati, che possono essere attribuiti all'autofluorescenza, e dovrebbe essere scelto per corrispondere allo spettro di emissione del fluoroforo.

2. Preparazione del campione

1. In vivo
   1. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione utilizzando isoflurano ad una concentrazione del 3-4% sul quadrante del flussometro.
   2. Trasferire l'animale in un cono nasale fissato nella fase di imaging e mantenere l'isoflurano ad una concentrazione dell'1-2%. Una fonte di calore non è necessaria perché gli animali vengono in genere ripresi solo per un breve periodo di tempo (> 5 minuti) e la loro temperatura corporea non diminuisce sostanzialmente.
   3. Proteggi le zampe dell'animale per ridurre al minimo gli artefatti di movimento. Rimuovere i capelli dalla regione di interesse applicando una crema depilatoria.
   4. Applicare la crema depilatoria sulla più piccola area necessaria. Dopo 30 s, pulirlo con una garza. Pulire l'area una seconda volta con un tampone di garza inumidito con alcool etilico per rimuovere completamente la crema depilatoria.
   5. Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione delle cornee.
   6. Iniettare la sonda molecolare fluorescente attivabile nell'animale. Per questa specifica applicazione, le sonde attivabili MMP2 sono state iniettate per via endovenosa nella vena della coda. A questo punto, il mouse può essere ripreso. Procedere alla "Acquisizione immagini" di questo protocollo per continuare. Monitorare l'animale per una respirazione regolare durante la breve procedura.
2. Ex Vivo
   1. Dopo l'iniezione della sonda fluorescente, l'eutanasia dell'animale in modo umano secondo le linee guida AVMA del 2013 per l'eutanasia degli animali. L'overdose di anidride carbonica (CO₂₎è una pratica standard per l'eutanasia di piccoli animali.
   2. Estrarre chirurgicamente il tessuto o l'organo di interesse e rimuovere con cura il tessuto adiposo in eccesso con una pinza.
   3. Risciacquare il tessuto in soluzione salina tamponata con fosfato per rimuovere il sangue residuo e posizionare il campione direttamente sulla fase di imaging.

3. Acquisizione di immagini

1. Aprire il software di imaging molecolare e accendere sia la sorgente luminosa a fibra ottica che il sistema di imaging a fluorescenza.
2. Aprire la finestra di acquisizione e specificare il tipo di esposizione appropriato per lo studio. Le esposizioni disponibili includono: Esposizione standard per acquisire una singola immagine, Esposizione time lapse per acquisire una serie di immagini in un intervallo di tempo fisso ed Esposizione progressiva per acquisire una sequenza continua di esposizioni in tempi di esposizione diversi.
3. Selezionare Transilluminazione UV come fonte di illuminazione.
4. Utilizzando l'immagine in anteprima come riferimento, regolare la messa a fuoco dell'obiettivo, il campo visivo e l'f-stop/apertura nella camera del sistema di acquisizione per ottimizzare la qualità dell'immagine campionata. Regolare il tempo di esposizione e la posizione del campione.
5. Chiudere la finestra di anteprima e assicurarsi che tutti i parametri nella finestra di acquisizione corrispondano alle impostazioni della fotocamera e del filtro.
6. Fai clic su'Esponi'per acquisire e salvare l'immagine.
7. Il software di imaging molecolare standard fornisce in genere una varietà di strumenti analitici, di misurazione e di correzione delle immagini per quantificare i segnali di fluorescenza per l'analisi delle immagini.
8. Al termine della sessione di imaging, rimuovere il campione/animale, spegnere il sistema e pulire lo stadio di imaging per ridurre al minimo i danni al sistema.