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Imaging di campioni biologici con microscopia ottica e confocale

Panoramica

Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università del Connecticut, Storrs, Connecticut

I microscopi ottici sono in circolazione da secoli e, mentre hanno raggiunto il loro limite teorico di risoluzione decenni fa, nuove attrezzature e tecniche, come l'elaborazione di immagini confocali e digitali, hanno creato nuove nicchie nel campo dell'imaging ottico. I migliori microscopi ottici avranno in genere una risoluzione fino a 200 nm in condizioni ideali. Tuttavia, i microscopi ottici sono limitati dalla diffrazione delle onde, una funzione della lunghezza d'onda, che è di circa 500 nm per la luce visibile. Mentre la risoluzione dei microscopi ottici non raggiunge quella dei microscopi elettronici, sono gli strumenti più preziosi nell'imaging di macrostrutture biologiche e sono un punto fermo in qualsiasi laboratorio biologico.

Nei microscopi ottici convenzionali, il segnale prodotto dall'oggetto ripreso proviene dall'intero spessore del campione, il che non consente alla maggior parte di esso di essere a fuoco per l'osservatore. Ciò fa sì che l'immagine abbia una "sfocatura sfocata". Il microscopio confocale, d'altra parte, illumina il campione attraverso un foro di spillo, ed è quindi in grado di filtrare la luce fuori fuoco dall'alto e dal basso del punto di messa a fuoco nell'oggetto.

Questa dimostrazione fornisce un'introduzione all'acquisizione di immagini utilizzando metodi di microscopia ottica e confocale. Qui, verrà studiato un pezzo sezionato del cervello del topo.  Saranno trattati l'acquisizione e l'analisi delle immagini, compresi gli strumenti per generare mappe topografiche e immagini composite. Verranno inoltre discussi i vantaggi e gli svantaggi dei diversi metodi di imaging in relazione alla risoluzione, alla profondità di messa a fuoco e al tipo di campione. Lo scopo di questa dimostrazione è quello di fornire maggiori informazioni sui microscopi ottici e confocali per determinare se questi moduli di microscopia sono la soluzione migliore per un tipo di campione biologico.

Procedura

1. Imaging confocale

  1. Caricare il campione sullo stage. Centralo sotto l'obiettivo. Non deve superare il limite di peso del palcoscenico, che in questo caso è di 5 kg. Il campione non deve avere uno spessore superiore a 100 mm.
  2. Apri il software di imaging e seleziona "Crea lavoro".
  3. Sotto la colonna Topografie, scegli il pulsante assistente.
  4. Crea un'immagine panoramica con l'ingrandimento più basso, 2,5X. Prima di cambiare gli ingrandimenti, assicurarsi che il campione sia a

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Risultati

Le seguenti immagini forniscono una panoramica dei risultati che possono essere ottenuti da un cervello di topo utilizzando un microscopio confocale. Mostrano come è possibile ottenere diversi livelli di informazioni e come una mappa topografica dei risultati rivela l'altezza del campione.

Figure 5
Figura 5

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Tags
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0:07

Overview

1:26

Principles of Confocal Microscopy

3:37

Confocal Imaging

6:09

Digital Optical Microscope

7:56

Results

9:05

Applications

10:16

Summary

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