Inizia preparando una quantità sufficiente di miscela di elettroporazione per il controllo e il gene di interesse. Collegare la camera dell'elettrodo a piastra di Petri all'elettroporatore. Quindi, utilizzando le punte Microloader, riempire gli aghi di microiniezione con 8 microlitri di ciascuna miscela di elettroporazione.
Tagliare le punte degli aghi prima dell'uso per ottenere un flusso stabile usando forbici sottili. Assicurarsi di rimuovere solo una piccola parte della punta poiché una punta smussata e larga può danneggiare gravemente gli organoidi. Al microscopio, scegli cinque organoidi cerebrali con bordi lisci e strutture simili a ventricole visibili.
Quindi spostarli in un piatto di coltura cellulare da 35 millimetri contenente DMEM / F-12 preriscaldato utilizzando una punta di pipetta tagliata da 1000 microlitri. Ora, inserire con attenzione l'ago attraverso la parete di una struttura simile a un ventricolo e infonderlo con la miscela di elettroporazione fino a quando non è visibilmente riempito. Non applicare una pressione eccessiva sulle strutture simili a ventricole per evitare lo scoppio.
Trasferire un organoide cerebrale microiniettato nella camera dell'elettrodo della piastra di Petri con una piccola quantità di DMEM/F-12. Disporre l'organoide in modo che le superfici delle strutture simili a ventricole microiniettate siano rivolte verso l'elettrodo collegato al polo positivo dell'elettroporatore. Ora, elettroporate gli organoidi cerebrali uno per uno usando cinque impulsi di 80 volt per 50 millisecondi ciascuno con un intervallo di un secondo.
Se la microiniezione e l'elettroporazione sono state eseguite in condizioni non sterili, spostare gli organoidi elettroporati sotto una cappa a flusso laminare in un nuovo piatto di coltura cellulare da 35 millimetri riempito con DMEM / F-12 preriscaldato. Quindi coltivare gli organoidi elettroporati in DM con vitamina A su uno shaker orbitale a 55 RPM in un'atmosfera umificata di 5% di anidride carbonica e 95% di aria a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, dopo l'elettroporazione, controllare gli organoidi cerebrali per un'elettroporazione di successo sotto un microscopio a fluorescenza invertita convenzionale.
Trasferire gli organoidi elettroporati in una provetta conica da centrifuga da 15 millilitri utilizzando una punta di pipetta tagliata da 1000 microlitri e rimuovere il mezzo in eccesso. Aggiungere una quantità sufficiente di paraformaldeide al 4% in DPBS e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare la paraformaldeide.
Quindi aggiungere 5 millilitri di DPBS, agitare delicatamente e aspirare il DPBS. Conservare gli organoidi in DPBS a 4 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Due giorni dopo l'elettroporazione, le cellule GFP-positive sono localizzate quasi esclusivamente nella zona ventricolare e sono positive per Pax6, indicando che queste cellule sono progenitori apicali o progenitori basali appena nati.
Dopo 10 giorni, le cellule GFP-positive sono localizzate nelle regioni basali. Queste cellule sono anche positive per Pax6 o NeuN, che è indicativo di progenitori basali o neuroni, rispettivamente. Viene mostrata la ricostruzione 3D degli organoidi cerebrali elettroporati per ottenere un'impressione della distribuzione 3D delle cellule GFP-positive.
