Name: microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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Gli autori vorrei ringraziare David Langenau per generosamente offrendo spazio acquario; Eric Stone, John e Qin Tang per aiutare con manutenzione di zebrafish e reagenti e Anne Robertson ed Elliott Hagedorn dal laboratorio di Leonard Zon per procurare il ceppo di zebrafish utilizzato qui. Vorrebbero anche grazie a Octavio Hurtado per consigli sulle tecniche fotolitografiche. FE è stato finanziato da borse di studio dal Hospital di Shriner per bambini e l'American Association australiana. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere GM92804.

Microinjection delle larve è stato approvato dalla Massachusetts General Hospital sottocommissione per ricerca Animal Care sotto protocollo 2011N000127.
1. fabbricazione di dispositivi
Nota: Tutti i assistita da computer (CAD) file di disegno utilizzati per la progettazione di maschere di fotolitografia descritte qui (Figura 1) sono disponibili per il download. Vedi tabella materiali per i collegamenti.
<ol><li>Fabbricare il wafer di stampo master in camera bianca classe 1.000 utilizzando tecniche fotolitografiche standard7. Per le matrici di microstruttura e canali, modello il photoresist negativo a base epossidica in sequenza a 3 strati usando 3 maschere separate, secondo le istruzioni del produttore: 100 µm per le caratteristiche superficiali, 200 µm per le caratteristiche medie e 400 µm per le caratteristiche profonde. Per il dispositivo di imaging, modello due strati utilizzando 400 µm per le caratteristiche superficiali e 600 µm per le caratteristiche profonde.</li>
	<li>Nastro la cialda completata alla base di un 15 cm di Petri per colata (Figura 2).</li>
</ol>2. preparazione di matrici superficie microstrutturate - PDMS
<ol><li>Per rendere utilizzabile dispositivi, eseguire il cast polidimetilsilossano (PDMS), utilizzando il master wafer come uno stampo. 50 g di monomero PDMS si combinano con 5 g di iniziatore e mescolare accuratamente in un piatto di pesatura con una forchetta di plastica di plastica.</li>
	<li>Versare il composto con attenzione sopra lo stampo.</li>
	<li>Degas in un essiccatore sotto vuoto a 16-25 inHg (54-85 kPa) per 1 h.</li>
	<li>Per curare il PDMS, cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore. Il PDMS dovrebbe curare un solido duro ma flessibile.</li>
	<li>Accuratamente tagliato intorno al dispositivo sul wafer master utilizzando un bisturi, assicurandosi di mantenere il contatto tra la punta del bisturi e la superficie del wafer. Usando il forcipe, sbucciare la replica PDMS lontano la cialda e il trasferimento a un pulito 10 cm di Petri, lato di funzionalità (Figura 3).</li>
	<li>Trattare il dispositivo con il plasma di ossigeno utilizzando un forno al plasma per 35 s per ridurre idrofobicità.</li>
	<li>Coprire con il supporto di embrione di zebrafish (E3) che contiene 168 mg/L di etile 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Rimuovi qualsiasi bolle da più profonde caratteristiche di flusso d'acqua sopra la superficie del dispositivo utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
</ol>3. preparazione di matrici superficie microstrutturate - agarosio
<ol><li>Per fare uno stampo negativo di PDMS, in primo luogo trattare un dispositivo PDMS con plasma ad ossigeno.</li>
	<li>
Trattare il dispositivo PDMS con 1H, 1H, 2H, 2Hvapor di silano - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) per creare una superficie inerte8. Brevemente:
	<ol>
<li>Posto il PDMS essere trattata caratteristica-side-up in una camera a vuoto all'interno di una cappa aspirante.</li>
		<li>Accanto il PDMS, posizionare un piccolo piatto di vetro o alluminio aperto e attentamente Pipettare 200 µ l di PFDTS (98% Silano) nel piatto. Attenzione: Silano PFDTS è altamente volatile, reagisce violentemente con l'acqua, è infiammabile e causa gravi danni della pelle e degli occhi sul contatto. Leggi MSDS in dettaglio prima dell'uso.</li>
		<li>Chiudere la camera a vuoto e applicare il vuoto per 15-30 minuti, o fino a quando il silano PFDTS è completamente evaporato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collocare il dispositivo in una capsula di Petri e utilizzare come uno stampo per PDMS fresco, preparato come descritto al punto 2.1-2.3.</li>
	<li>Cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore, poi sbucciare l'intero livello di PDMS fresco dal dispositivo trattato e posto in una capsula Petri fresco. Quindi utilizzabile come uno stampo negativo per eseguire il cast dell'agarosi.</li>
	<li>Per preparare dell'agarosi, far bollire una soluzione di 2% di basso gelificante temperatura agarosio in E3 in un forno a microonde finchè l'agarosio sia completamente dissolto.</li>
	<li>Versare l'agarosio caldo sopra lo stampo negativo di PDMS e rimuovere tutte le bolle in agarosio che copre il dispositivo di agarosio caldo che scorre oltre le caratteristiche con una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Una volta che bolle vengono rimossi, conservare in frigorifero a 4 ° C per impostare l'agarosio.</li>
	<li>Rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo negativo PDMS deformando il PDMS da sotto a mano, trasferimento del blocco di agarosio per una nuova piastra di Petri e bagnarlo con E3 contenente MS-222.</li>
</ol>4. preparazione di PDMS periferiche di Imaging
<ol><li>Per rendere utilizzabile dispositivi, eseguire il cast PDMS, utilizzando il master wafer come uno stampo. 50 g di monomero PDMS si combinano con 5 g di iniziatore (uguale a quello usato nel passaggio 2.1) e mescolare accuratamente in un piatto di pesatura con una forchetta di plastica di plastica.</li>
	<li>Versare il composto con attenzione sopra lo stampo.</li>
	<li>Degas in un essiccatore sotto vuoto a 16-25 inHg (54-85 kPa) per 1 h.</li>
	<li>Per curare il PDMS, cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore. Il PDMS dovrebbe curare un solido duro ma flessibile.</li>
	<li>Tagliare i dispositivi da Master Wafer e punch out porte usando un punzone di 1,5 mm.</li>
	<li>Trattare i dispositivi e un 6-pozzetti con fondo di vetro ben piatto con plasma ad ossigeno per 35 s, come descritto al punto 2.6.</li>
	<li>Legame uno dispositivo funzionalità-lato-giù per ogni vetrino coprioggetti della piastra 6 pozzetti inserendolo in una piastra di 85 ° C per 10 min. Nota: Per confermare il successo incollaggio, applicare la pressione costante su un lato del dispositivo incollato usando il forcipe. Il dispositivo dovrebbe rimanere il vetrino coprioggetti.</li>
</ol>5. Zebrafish cultura
<ol><li>Embrioni di zebrafish di cultura a 2 dpf utilizzando tecniche standard3.</li>
	<li>Dechorionate embrioni usando proteasi forcipe o 1 mg/mL mix (Vedi materiali tavolo)3 almeno 30-60 minuti prima di caricarli sul dispositivo, per consentire loro di raddrizzare.</li>
	<li>Anestetizzare embrioni usando la soluzione di riserva (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) aggiungendo 1 mL di 25x per l'E3 in loro di Petri.</li>
</ol>6. orientamento di Zebrafish sulla superficie microstrutturata - Divot matrici
<ol><li>Preparare il blocco PDMS da passo 2.7 (Figura 3A) nella sua scatola di Petri tale che è coperto da uno strato sottile (1-2 mm) di E3, che permette una più facile manipolazione degli embrioni.</li>
	<li>Trasferire il numero necessario di embrioni (in genere 10-20 a condizione) sulla superficie del blocco PDMS utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Utilizzando uno strumento di micromanipolazione (ciclo dei capelli o simili), spingere gli embrioni il divots microstrutturata (Figura 3A). Utilizzo di divots è particolarmente indicato per gli orientamenti dorsali e ventrali. Nota: Per le punte con un più stretto misura (dorsale e ventrale), provare gli embrioni di posizionamento sulla superficie del blocco in parallelo con il divot e poi rotolare nella posizione usando un ciclo dei capelli. Spingendoli più profondo nel divot aiuterà a tenerli stabili.</li>
</ol>7. orientamento di Zebrafish sulla superficie microstrutturata - microstrutturate canali
<ol><li>Disegnare E3 il blocco di PDMS modellato con canali microstrutturate (Figura 3B) usando una pipetta di trasferimento fino a quando il livello di E3 scende di sotto del bordo del blocco, ma è ancora presente nel serbatoio e canali e in uno strato sottile sul PDMS.</li>
	<li>Trasferire 10 embrioni dal punto 5.3 nel serbatoio utilizzando una pipetta di trasferimento, facendo attenzione a non i bordi sfioratori.</li>
	<li>Utilizzando un ciclo di capelli, manipolare ogni embrione nell'imbuto all'ingresso del canale appropriato e orientare tale che la testa dell'embrione è verso il canale e l'embrione ha l'orientamento appropriato come entra nel canale.</li>
	<li>Far scorrere ogni embrione giù il canale utilizzando un ciclo di capelli fino a raggiungere la microfeatures orientante nelle pareti del canale che aiutano a tenerlo in posizione. Uso dei canali microstrutturate è particolarmente indicato per l'orientamento laterale. Nota: Per ridurre l'embrione scorrevole durante la microiniezione, provare a regolare la quantità di tensione superficiale disegnando E3 dal serbatoio.</li>
</ol>8. microiniezione di Zebrafish
<ol><li>
Preparare l'ago per microiniezione.
	<ol>
<li>Fare vetro borosilicato microcapillary aghi utilizzando un estrattore micropipetta come descritto in precedenza4. Gli aghi risultanti devono essere diminuito gradualmente in un punto ad un'estremità, con una lunghezza conica di circa 10 mm.</li>
		<li>Preparare la soluzione da iniettare, in questo caso 100 nM chemoattractant (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanina (fMLP) o il leucotriene B4 (LTB4)) e 100 nM di 70 kDa tracciante di destrano rodamina in PBS.</li>
		<li>Caricare l'ago usando una pipetta finemente affusolata 5 µ l di soluzione di punta (vedere tabella materiali).</li>
		<li>Montare l'ago in un micromanipolatore montato su un supporto magnetico e collegato ad un microinjector picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rompere la punta dell'ago a un angolo di 45 ° pizzicando la punta conica con il forcipe.</li>
	<li>Regolare la dimensione del bolo iniezione a 1 nL regolando il tempo di iniezione sul controller picopump.</li>
	<li>Regolare l'angolo dell'ago microiniezione. Un angolo di ago di 45 ° sul controller di micromanipolazione è generalmente un buon punto di partenza, con l'ago parallelo alla lunghezza dell'embrione. Un angolo più ripido può essere utilizzato per minimizzare il movimento laterale dell'embrione durante la microiniezione.</li>
	<li>Controllo di Petri con la mano sinistra e il micromanipolatore di ago con la destra, portare l'ago più vicino possibile al sito desiderato di microiniezione, in questo caso la vescicola otica. Nota: La vescicola otica può essere identificata come l'organo oblunga posteriore dell'occhio che contiene due più piccolo scure oblunghe strutture distinte (otoliti).</li>
	<li>Utilizzando il controller di micromanipolazione, penetrare il tessuto bersaglio (in questo caso la vescicola otica) tale che la punta dell'ago è all'interno della vescicola e iniettare il volume preimpostato utilizzando l'interruttore a pedale picopump. Nota: Se il tessuto resiste alla penetrazione, provare picchiettando delicatamente la manopola del regolatore di micromanipolazione.</li>
	<li>Per rilasciare gli embrioni, flusso E3 sopra la superficie da cima a fondo utilizzando una pipetta di trasferimento, o agitando il piatto, tale che gli embrioni vengono rilasciati in E3 circostanti.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni per un piatto di recupero di E3 senza MS-222 utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
</ol>9. selezione degli embrioni usando il dispositivo di Imaging di PDMS
<ol><li>Primo il dispositivo da passo 4.7 per fluire E3 (+ MS-222) attraverso la porta. Questo può essere fatto utilizzando una pipetta di 1.000 µ l o una stretta-punta delle pipette.</li>
	<li>Riempire il pozzetto con E3 + MS-222, fino a quando il dispositivo è coperto.</li>
	<li>Consegnare 4 embrioni iniettati dal passaggio 8,7 in ogni pozzetto usando una pipetta di trasferimento. Gli embrioni possono essere pre-anestetizzati se desiderato incubando in E3 + MS-222 per 1-2 min prima del caricamento (punto 5.3).</li>
	<li>Utilizzando uno strumento di micromanipolazione (ciclo dei capelli o simili), orientare gli embrioni presso gli ingressi dei canali imaging l'orientamento desiderato (coda-primo o testa prima, a seconda del dispositivo utilizzato) e spingerli parzialmente nel dispositivo (Figura 4A). Questo vi aiuterà a disegnarli in modo uniforme nel dispositivo.</li>
	<li>Disegnare E3 attraverso il dispositivo dalla porta utilizzando una pipetta di 1.000 µ l o pipetta fino a quando gli embrioni sono disegnati nei canali con l'orientamento corretto per l'imaging (Figura 4B). Nota: Fare attenzione a non succhiare gli embrioni oltre il punto di cattura, questo danneggerà gli embrioni e alterare il loro orientamento.</li>
	<li>Trasferimento piastra al microscopio per imaging (Figura 4).</li>
	<li>
Immagine utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza.
	<ol>
<li>Regolare ingrandimento selezionando la lente appropriata. 10 X è di solito un ingrandimento utile per l'imaging di migrazione del neutrofilo zebrafish.</li>
		<li>Regolare la sorgente luminosa intensità e tempo di esposizione per ogni canale affinché ogni segnale è chiaro, ma non saturo.</li>
		<li>Catturare immagini per ogni canale. Qui, abbiamo usato la proteina fluorescente verde (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) e canali di trasmissione. Immagini multicanale possono essere combinati in fase di elaborazione (Figura 4B-io).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Qui, descriviamo l'uso di dispositivi abbiamo recentemente sviluppato per facilitare 2 dpf zebrafish microiniezione5e introdurre un dispositivo semplice montaggio privo di agarosio per imaging conveniente degli embrioni. Questi strumenti evidenziano l'utilità delle tecniche fotolitografiche per la fabbricazione di dispositivi utili per le tecniche di zebrafish.
Abbiamo trovato questo dispositivi MSA particolarmente utile per l'iniezione di cellule o particelle incline all'aggregazione entro l'ago per microiniezione, quali conidi fungine o cellule tumorali umane, che richiedono l'uso di un ago di calibro più grande per la consegna. Iniezione nella vescicola otica (Figura 4) presenta una sfida particolare, come embrioni rotolo spesso a contatto con l'ago. Troviamo che l'uso di canali microstrutturati che orientare e stabilizzare il danio zebrato in una laterale orientamento notevolmente migliorato la produttività e la precisione di questa tecnica nelle nostre mani.
Per rappresentazione rapida di zebrafish lateralmente orientato a tempi diversi, quali la valutazione del reclutamento dei neutrofili o metastasi dello xenotrapianto, evitando di agarosio aumentata consistenza di montaggio tra embrioni e ridotta probabilità di danni durante il Post-formazione immagine rescue. Questi dispositivi inoltre mostrano la promessa per l'imaging del lasso di tempo prolungato e sono stati utilizzati per riuscire a catturare immagini multicanale, del multiplane con movimento di pesce minimo oltre 12 h. Perché non sono costretti di agarosio, allungamento attivo delle larve durante questo periodo (~ 300 µm da 54-78 hpf)11 è illimitato e può procedere normalmente.
I passaggi più critici nella preparazione e nell'uso di questi strumenti sono comuni per l'uso della maggior parte dei dispositivi microfluidici PDMS basato: i dispositivi devono essere accuratamente bagnati e bolle evitato. Per evitare tali problemi, bagnare i dispositivi in E3 immediatamente dopo che essi sono fabbricati, mentre la superficie idrofilia conferito dal trattamento al plasma di ossigeno è ancora presente. Ri-trattamento con plasma ad ossigeno è utilizzabile anche per ripristinare transitoriamente idrofilia invecchiato PDMS dispositivi.
Le geometrie precise utilizzate qui sfruttare l'alta risoluzione delle tecniche fotolitografiche, ma l'attuale uso di limite di disegni di zebrafish durante il secondo post-fertilizzazione di giorno. Ri-progettazione di geometrie basato sulla piattaforma attuale consentirebbe successo orientamento del 1 dpf e 3 dpf per il microinjection. Orientamento della più vivace 4 dpf larve con vesciche natatorie gonfiati sarebbe probabilmente più impegnativo e richiedono aderente geometrie in combinazione con una maggiore tensione della acqua. Dispositivi complessi, integrando il flusso o vuoto potrebbero fornire un approccio alternativo applicabile a una vasta gamma di stadi di sviluppo, ma richiederebbero anche uso di pompe e tubi, aumentando i costi e i rischi di guasto del dispositivo.
PDMS è un materiale economico, utile per la realizzazione di dispositivi come quelli descritti qui, fornendo la biocompatibilità, la trasparenza e la riusabilità. Uno svantaggio dell'utilizzo di dispositivi PDMS per zebrafish è idrofobicità, che può rendere difficile manutenzione degli strati superficiali della E3 sulla superficie del dispositivo. Questo problema può essere evitato eseguendo il cast i dispositivi di microiniezione in agarosio, anche se questo limita la riusabilità e aumenta la fragilità dei dispositivi. Un'alternativa preferita sarebbe identificazione di un trattamento di superficie biocompatibile che aumenta l'idrofilia di PDMS12, o l'uso di un substrato di plastica appropriato.
Metodi attuali per il microinjection di zebrafish al dpf 2 utilizzano acqua tensione4 o semplici canali cast in agarosio utilizzando stampi commerciali per immobilizzare e posizionare le larve. Questi approcci offrono un controllo limitato su orientamento e possono essere complicati dalla rapida asciugatura degli embrioni. Le microstrutture integrate con le zolle e canali utilizzati qui sono progettati per orientare e immobilizzare le larve senza dipendere interamente da tensione dell'acqua, riducendo così il rischio di essiccazione. Divots realizzati con stampi stampati 3D sono state precedentemente utilizzate per l'orientamento degli embrioni per scopi imaging13, anche se la profondità di questi divots loro resi inaccessibili per il microinjection.
Uso di sistemi microfluidici per l'imaging di zebrafish sta diventando sempre più comune14. Sistemi di flusso-attraverso multipli sono stati sviluppati per permettere l'osservazione dello sviluppo di zebrafish nel tempo con la capacità di introdurre composti su richiesta15,16,17. Dispositivi più complessi sono stati progettati per gli embrioni di matrice mentre ancora all'interno di loro corion, che fornisce una semplice geometria sferica che può essere facilmente manipolata con relativamente elevato throughput in questi sistemi18,19. Parecchi gruppi hanno sviluppato piattaforme per arraying e imaging zebrafish stadio larvale in vari orientamenti6,20, il più user-friendly è la micropompa passiva guidata "ZEBRA" sistema sviluppato dal laboratorio Beebe6 . A differenza del sistema ZEBRA, il dispositivo che descriviamo qui usa aspirazione, generato utilizzando una pipetta di trasferimento standard, per disegnare le larve nei canali, durante il caricamento parallelo piuttosto che sequenza delle larve permette il salvataggio delle larve singole post-imaging l'applicazione di flusso positivo attraverso la stessa porta. Inoltre, il nostro approccio richiede una più piccola orma, quindi dispositivi PDMS possono essere legati a piastre da 6 pozzetti convenzionale con fondo di vetro per l'imaging.
Il disegno sperimentale corrente utilizza dispositivi separati per microiniezione e principalmente in modo che possono essere utilizzati con strumentazione di microinjection convenzionali e standard di imaging Microscopi rovesciati. Esistono approcci microfluidici per il microinjection automatizzato di zebrafish uova già21, e in combinazione con metodi di tipo "pesce-trappola" per arraying altamente accurate e l'orientamento delle larve20, è prevedibile che integra i dispositivi Imaging e automatizzato iniezione larvale può anche un giorno diventare una realtà.

Zebrafish sono emerse come un potente modello per molti campi, dagli studi di biologia dello sviluppo fondamentale a larga scala genetica e chimica schermi1,2. Sistematiche manipolazioni genetiche, come la sovraespressione genica, atterramento, CRISPR/Cas9 mutagenesi e transgenesi si basano su microiniezione di materiale genetico in singola cellula zigote, che ha portato allo sviluppo di semplice, facile da usare, nel commercio strumenti disponibili per orientare e stabilizzare le uova per iniezione3. Altri approcci, come il trapianto e l'infezione, spesso richiedono microiniezione in embrioni in fase successivi e larve utilizzando più grande calibro capillare aghi4. Tuttavia, uso di aghi di calibro più grandi presenta significative sfide tecniche, come è più difficile penetrare il tessuto dell'obiettivo senza spingere o l'embrione di rotolamento. In queste condizioni, ottenendo la tensione adatta dell'acqua necessaria per stabilizzare l'embrione, mentre è difficile evitare essiccazione durante la procedura e gli embrioni non può non essere idealmente orientato per l'iniezione nel tessuto bersaglio.
A seguito di microiniezione, è spesso utile paravento embrioni iniettati per selezionare quelli che sono stati iniettati con successo e per catturare le immagini del punto di tempo iniziale. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato una gamma di dispositivi microstrutturati che aiutano a stabilizzare 2 dpf embrioni in vari orientamenti microiniezione5sia per post-iniezione screening rapido basato sulle immagini.
Per ottenere una risoluzione sufficiente strutturale in questi dispositivi, abbiamo utilizzato le tecniche fotolitografiche. Comunemente impiegati nell'industria microelettronica e più recentemente estrapolato a microfluidic fabrication, questi approcci possono realizzare strutture verticali che vanno da 1-1.000 µm, una scala adatta alla manipolazione di embrioni di zebrafish e larve. Tutti i dispositivi sono stati fabbricati con polidimetilsilossano (PDMS), che è a buon mercato, fisicamente robusto, biologicamente inerte e trasparente.
Matrici di superficie microstrutturate (MSAs) sono state formattate come blocchi di PDMS con una superficie superiore a motivi, analoga ai canali semplici in agarosio blocchi comunemente usati per il microinjection di uovo. Per post-iniezione screening, 6 dispositivi di imaging possono essere schierati in una piastra 6-pozzetti con fondo di vetro standard. Questi dispositivi sono progettati per un facile caricamento di embrioni, mentre la procedura di scarico permette comodamente di salvataggio degli embrioni specifici, facilitando basata su immagine approcci di screening in modo più user-friendly rispetto quei dispositivi precedentemente sviluppato dalla Beebe laboratorio6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafish sono emerso come un potente modello di varie malattie umane e uno strumento utile per una gamma crescente di studi sperimentali, che abbracciano fondamentale biologia inerente allo sviluppo attraverso agli schermi di genetici e chimici su larga scala. Tuttavia, molti esperimenti, soprattutto quelli legati alla infezione e modelli dello xenotrapianto, si basano su microiniezione e l'imaging di embrioni e le larve, che sono laboriose tecniche che richiedono abilità e competenze. Per migliorare la precisione e la velocità di trasmissione di corrente microiniezione, abbiamo sviluppato una serie di dispositivi microstrutturati per orientare e stabilizzare gli embrioni di zebrafish 2 giorni post fertilizzazione (dpf) nell'orientamento ventrale, dorsale o laterale prima dei procedura. Per facilitare l'imaging di embrioni, abbiamo anche disegnato un semplice dispositivo con canali che orientano 4 zebrafish lateralmente in parallelo contro un vetro vetrino coprioggetti. Insieme, gli strumenti che vi presentiamo qui dimostrano l'efficacia di approcci fotolitografica per generare dispositivi utili per l'ottimizzazione delle tecniche di zebrafish.

L'approccio descritto qui di seguito viene illustrato il disegno (Figura 1) e la fabbricazione di dispositivi per l'utilizzo con 2 dpf zebrafish, utilizzando fotolitografica (Figura 2) e tecniche di soft-litografiche (Figura 3). Questo metodo consente di testare rapidamente molte iterazioni di progetto e modifiche, e le alterazioni e l'ottimizzazione delle dimensioni di microstruttura per l'uso con il danio zebrato in altre fasi di sviluppo possono estendere la loro applicazione.
Dimostriamo di utilizzo di questi dispositivi per microiniezione impegnativo e conveniente imaging. La vescicola otica (Figura 4, bianco contorno tratteggiato) fornisce un sito utile, immunitario privilegiato e isolato per i test di reclutamento dei neutrofili in zebrafish9. Per verificare la capacità dei neutrofili di zebrafish per rispondere agli standard chemioattrattanti, 100 nM di fMLP e LTB4 sono stati microiniettati in vescicole otic 2 embrioni di zebrafish dpf (Figura 4F, J), utilizzando il dispositivo di canale microstrutturata ( Figura 1) per stabilizzare gli embrioni con l'orientamento laterale. Iniezioni erano tracciate con alto peso molecolare del dextrano rodamina ed eseguite in embrioni di Tg(mpx:EGFP) per facilitare la visualizzazione del reclutamento dei neutrofili. Uninjected embrioni (Figura 4, H) ed embrioni iniettati con rodamina da solo (Figura 4E, io) sono stati utilizzati come controlli negativi. A seguito di microiniezione, gli embrioni sono stati trasferiti al dispositivo di imaging channel (Figura 1A, B) e imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza EVOS (Figura 4) a 30 min e 5 h post iniezione (Figura 4- G e Figura 4 H-K, rispettivamente). Come previsto, un piccolo numero di neutrofili fluorescenti sono stato reclutato per la vescicola otica mock-iniettato al timepoint iniziale (Figura 4I), probabilmente a causa di danni-mediata assunzione. È interessante notare che, il tracciante di destrano rodamina è stato osservato ad accumularsi nella otoliti durante l'esperimento. Per entrambi chemioattrattanti (Figura 4F, J), i neutrofili sono stati reclutati in numeri più alti, soprattutto in risposta alla LTB4 (Figura 4F).
I risultati rappresentativi mostrati qui dimostrano il riuscito uso di questo metodo per il microinjection e formazione immagine di zebrafish. Nel contesto dell'analisi di reclutamento dei neutrofili di zebrafish, applicazione di questi strumenti in combinazione con dettagliate dal vivo tecniche di imaging e migrazione cellulare sofisticate analisi10 può fornire una piattaforma utile per futuri esperimenti in questo campo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> Figura 1: Computer assistita disegno disegno (CAD) delle maschere di fotolitografia. (A-C) Disegno CAD per superficie microstrutturata divots per posizionamento dorsale (C) orientamenti, ventrale (B) e laterale (A). Diverse linee colorate rappresentano CAD disegni di maschera per caratteristiche diverse, con verde 100 µm, blu 200 µm e rosso 400 µm caratteristica altezze. Barra della scala = 500 µm. (D-F) CAD design per microstrutturata canali per posizionamento dorsale (F) orientamenti, ventrale (E) e laterale (D). Diverse linee colorate rappresentano disegni maschera per caratteristiche diverse, con verde 100 µm, blu 200 µm e rosso 400 µm caratteristica altezze. Barra della scala: 500 µm. (G-io) disegno CAD per l'imaging di dispositivi progettati per caricamento a capofitto (G) o coda-primo (H e I). Linee blu rappresentano 400 µm caratteristiche, mentre linee rosse rappresentano 600 µm caratteristiche. Le frecce indicano la direzione in cui le larve vengono caricate. Barra della scala = 200 µm. Questa figura è stata modificata da Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> Figura 2: wafer master Silicone. (A) sezione superiore della cialda master caratteristiche di spettacoli per l'orientamento individuale larve in divots. (B) sezione di master wafer con disegno per canali microstrutturate di fondo. Questa figura è stata modificata da Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> Figura 3: dispositivi microstrutturati PDMS. (A) PDMS blocco il cast da master wafer risultati divots per orientare le larve individuali. (B) PDMS bloccare cast da master wafer risultati microstrutturate canali. Questa figura è stata modificata da Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> Figura 4: risultati rappresentativi: Imaging reclutamento dei neutrofili di zebrafish dopo consegna di microiniezione di chemioattrattanti nella vescicola otica. (A-B) Caricamento e gli embrioni per l'imaging di montaggio. (A), il capo-primo dispositivo con embrioni pronti per il caricamento, con la porta indicata (freccia nera). (B) il caricato embrioni dopo che sono state tratte in posizione (freccia gialla). (C) piastra 6-pozzetti con fondo di vetro con periferiche sul microscopio. Questo formato consente di imaging di 4 lateralmente orientato embrioni per pozzetto (in totale 24 embrioni), usando un microscopio invertito standard. (D-G) Neutrofili (verde-EGFP) in un uninjected (D) embrione e seguenti vescicola otica microinjection di destrano rodamina (punta rossa, aperto bianco) da solo (E), 100 nM LTB4 (F) e 100 nM fMLP (G) 30 min dopo l'iniezione (mpi). (H-K) Neutrofili (verde-EGFP) in un embrione (H) uninjected e 5 h dopo vescicola otica microinjection di destrano rodamina (punta rossa, aperto bianco) da solo (ho), 100 nM LTB4 (J) e 100 nM fMLP (K) 5 h post iniezione ( HPI). Barra della scala = 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Ricerca

Bioingegneria

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biologia dello sviluppo

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Neuroscienze

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune cell migration. Microfluidic devices are used for entrapment to support long-term imaging of multicellular organisms, including zebrafish. However, the fabrication of these devices using soft lithography requires specialized facilities and competency in 3D printing, which may not be accessible to every lab. Our adaptation of a previously developed low-cost polyethylene terephthalate lamination method for constructing microfluidic devices increases accessibility by enabling design fabrication and iteration for a fraction of the technical investment of conventional techniques. We use a device made with this method, the Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), to accommodate drug treatment, manual wounding, and long-term imaging of up to four embryos in the same field of view. With this new design, we successfully capture gross morphological characteristics of the calcium&#160;signal around laser ablation and manual transection wounds for multiple embryos in the 2 h immediately following injury, as well as neutrophil recruitment to the wound edge for 24 h.

An innovative method for fabricating microfluidic devices using polyethylene terephthalate (PET) lamination significantly reduces the cost and complexity of entrapping and imaging multiple live zebrafish embryos.

Disegni microfluidici di laminazione in polietilene tereftalato a basso costo per l'imaging multiplexato di zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...