Preparare una macchina di congelamento ad alta pressione o HPF, almeno due ore prima di iniziare l'esperimento secondo le istruzioni del produttore. Trasferire i supporti in alluminio HPF di tipo A in un tubo di centrifuga da due millimetri contenente un millilitro di etanolo e sonicarli in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti. Asciugare i supporti in una capsula di Petri coperta con carta da filtro qualitativa.
Immergere i vettori pre-puliti in 1-esadecene. Utilizzare una pinzetta fine per raccogliere un disco di zaffiro pre-preparato dal piatto di coltura cellulare HeLa. Toccare la superficie etichettata con carta da filtro qualitativa per rimuovere il mezzo in eccesso.
Montare il disco di zaffiro nel supporto del campione HPF e tappare rapidamente il disco con un supporto in alluminio profondo 0,025 millimetri contenente 1-esadecene. Aspirare la soluzione in eccesso con carta da filtro qualitativa. Caricare il supporto del campione per il congelamento ad alta pressione.
Scaricare il gruppo portadischi in zaffiro sotto azoto liquido in una scatola criogenica di schiuma. Preparare due millilitri di fissazione di congelamento-sostituzione o soluzione FSF uno in un contenitore rotondo di polipropilene da 20 millimetri in una cappa aspirante e congelarlo utilizzando azoto liquido. Utilizzare una coppia di pinzette pre-raffreddate per caricare i dischi di zaffiro e i gruppi di supporto nel contenitore con soluzione FSF congelata uno sotto azoto liquido.
Trasferire questo contenitore in una camera della macchina di sostituzione del congelamento automatizzata pre-raffreddata per la lavorazione FSF a meno 90 gradi Celsius. Mantenere i campioni a meno 90 gradi Celsius per un'ora, quindi separare i dischi di zaffiro dai supporti con pinzette pre-raffreddate, assicurandosi che i lati marcati dei dischi di zaffiro siano rivolti verso il basso. Mantenere i campioni a meno 90 gradi Celsius per altre 8-10 ore prima di riscaldarsi fino a meno 60 gradi Celsius entro tre ore.
Sostituire la soluzione FSF nel contenitore con acetone pre-raffreddato e incubare a meno 60 gradi Celsius per un'ora. Ripeti questo lavaggio con acetone due volte. Riscaldare fino a meno 30 gradi Celsius entro tre ore.
Nel frattempo, preparare e pre-raffreddare due millilitri di soluzione FSF due in un tubo da centrifuga da due millilitri a meno 30 gradi Celsius. Sostituire l'acetone con la soluzione FSF due e incubare a meno 30 gradi Celsius per tre ore. Quindi sostituire la soluzione FSF due nel contenitore con acetone pre-raffreddato e incubare per 30 minuti a meno 30 gradi Celsius.
Ripeti questo lavaggio con acetone due volte. Caldo per meno 30 a 4 gradi Celsius entro due ore. Sostituire l'acetone con due millilitri di tampone HEPES da 0,2 molari.
Cambiare il tampone una volta e incubare a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius durante la notte.
