Prendere un disco di zaffiro trattato HPF e FSF pre-preparato contenente cellule HeLa stabili, lavarlo con tampone PBS-A per cinque minuti e ripetere questo processo tre volte. Trasferire i dischi di zaffiro in un piatto di coltura da 35 millimetri contenente un millilitro di tampone PBS-A a temperatura ambiente. Sostituire il tampone PBS-A nel piatto di coltura con un millilitro di soluzione riducente e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Preparare il precursore dell'oro in un millilitro di soluzione riducente e mescolare immediatamente a vortice. Aggiungere 80 microlitri di D-Penicillamina da 500 millimolari in acqua bidistillata alla soluzione precursore dell'oro. E subito vortice.
Sostituire la soluzione nel piatto coltivato con un millilitro di soluzione precursore d'oro e incubare per due ore a quattro gradi Celsius. Aggiungere da 20 a 100 microlitri della soluzione di boroidruro di sodio appena preparata alla soluzione precursore dell'oro, agitare immediatamente per mescolare bene e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Sostituire la soluzione con due millilitri di tampone PBS-A per fermare la reazione.
Quindi preparare la miscela di resina epossidica secondo le istruzioni del produttore, trasferire i dischi di zaffiro in capsule a fondo piatto e infiltrarsi con resina per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Polimerizzare il campione a 60 gradi Celsius in forno per almeno 18 ore. Preparare sezioni ultrasottili del campione polimerizzato tagliando accuratamente i blocchi del campione usando un rasoio per esporre i dischi di zaffiro.
Immergere le punte dei blocchi con dischi di zaffiro in azoto liquido per alcuni secondi e scongelare la temperatura ambiente. Ripetere più volte l'azione di congelamento-scongelamento per staccare i dischi dai blocchi. La proteina EGFP-MTn-KDEL è apparsa come nanoparticelle d'oro di dimensioni da due a cinque nanometri distribuite esclusivamente nel lume periferico ER e nello spazio perinucleare dell'involucro nucleare.
La struttura ultra ben conservata ha permesso l'identificazione di singole molecole di proteine marcate e ha facilitato l'analisi delle interazioni degli organelli, come le interazioni dei mitocondri ER. Le nanoparticelle della proteina Ost4-EGFP-MTn hanno delineato la membrana ER nella membrana esterna dell'involucro nucleare. Allo stesso modo, le cellule che esprimono Mito-acGFP-MTn hanno mostrato una marcatura specifica nella matrice mitocondriale.
