Per iniziare, prendi il transwell fisso con colture RPE caricate con lipofuscina. Dopo aver lavato le colture con PBS cinque volte, lasciare una piccola quantità di PBS nella camera apicale. Posizionare il transwell capovolto sotto un microscopio da dissezione.
Utilizzando una lama di rasoio, tagliare la membrana semiporosa dal transwell applicando la forza di taglio alla giunzione della membrana e del transwell. Una volta tagliata la membrana transwell, posizionarla su un vetrino da microscopio usando una pinza. Pulisci il PBS in eccesso con una pulizia delle attività evitando di toccare le cellule.
Aggiungere il supporto di montaggio seguito da una vetrina. Assicurati di tenere traccia di quale lato del transwell è il lato destro verso l'alto. Successivamente, rilevare l'antigene di interesse utilizzando un fluoroforo, con eccitazione di picco di circa 488 nanometri e rilevamento delle emissioni a 500-530 nanometri.
Impostare un canale separato per il rilevamento dell'autofluorescenza, con eccitazione a 405 nanometri ed emissione da 585 a 635 nanometri. I granuli autofluorescenti indotti da OxOS hanno mostrato un maggiore accumulo dopo 20 poppate rispetto a cinque poppate. L'imaging raziometrico ha aiutato a decifrare l'autofluorescenza UAM da LC3 marcato con Alexa 488.
Il canale rosso contiene solo materiale di autofluorescenza non digeribile e ha contribuito a separare il segnale LC3 dal canale verde.
