Per iniziare, calcola il numero di pozzi necessari per l'esperimento. Quindi, scongelare una quantità appropriata di campione di sistema operativo normale. Aggiungi abbastanza supporti RPE per ottenere una concentrazione finale del sistema operativo di quattro volte 10 al sesto per millilitro.
Rimuovere il mezzo apicale e aggiungere 50 microlitri di quattro volte 10 al sesto OS per millilitro con concentrazioni appropriate di leganti a ponte. Dopo l'aggiunta del sistema operativo, incubare i campioni per vari punti temporali. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 16,67 microlitri di tampone campione quattro volte Laemmli con inibitori della proteasi per lisare sia le cellule che l'OS sovrastante contenente surnatante.
Utilizzando una pipetta P200, grattare la superficie di Transwell e raccogliere insieme il surnatante cellulare combinato e il lisato cellulare. Vortice e lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti per una completa denaturazione. La macchia occidentale della rodopsina ha mostrato che la banda di rodopsina intatta era indistinguibile nel controllo e nelle cellule RPE cariche di UAM.
Tuttavia, i prodotti di scissione della rodopsina erano più alti nel gruppo UAM, suggerendo una lieve disfunzione degradativa nel sistema fagolisosomiale. I livelli uguali di GAPDH indicano che il conteggio delle cellule tra i pozzetti è uguale. Diversi anticorpi rodopsina riconoscono diversi frammenti di degradazione.
4D2 riconosce il terminale finale della rodopsina che è intatto fino alle ultime fasi della degradazione lisosomiale. Al contrario, 1D4 riconosce il terminale C della rodopsina che è degradato in precedenza nel processo fagolisosomiale.
