Per iniziare la preparazione del campione, sezionare la vera foglia dal campione transgenico di Arabidopsis thaliana trattato farmacologicamente usando una lama di rasoio affilata. Posizionare la foglia vera su un vetrino in una goccia d'acqua con il lato abassiale verso l'alto. Coprire lentamente la foglia vera con un foglietto di copertura senza bolle d'aria.
Per l'imaging, impostare il percorso del fascio selezionando un laser a 514 nanometri per la proteina fluorescente gialla o l'eccitazione YFP. Ottieni un'elevata qualità dell'immagine utilizzando un'elevata potenza laser. Attivare PMT o HYD e definire le soglie della banda di emissione superiore e inferiore in base allo spettro per il fluoroforo YFP.
Impostare una finestra di rilevamento da 530 a 570 nanometri per raccogliere il segnale YFP. Per l'immagine sequenziale del secondo colore, fai clic sul pulsante Cerca e aggiungi un nuovo canale. Nella ricerca due, selezionare un laser a 555 nanometri per la proteina fluorescente rossa, o eccitazione RFP, e impostare una finestra di rilevamento da 570 a 630 nanometri per raccogliere il segnale RFP.
Selezionare una lente centrale 63X, 1,2W sul sistema per l'imaging dell'attività del traffico della membrana subcellulare all'interno delle cellule precursori stomatiche. Inizia il formato con una dimensione dell'immagine di 1024 per 1024 pixel, quindi ottimizzalo in base al fattore di zoom e alle impostazioni dell'obiettivo per una buona risoluzione. Successivamente, impostare la velocità della testina di scansione, a partire da una velocità di 400 hertz, e ottimizzarla in base alla situazione specifica dei campioni.
Per ingrandire una regione di interesse senza modificare l'obiettivo, immettere un fattore di zoom pari a uno e ottimizzarlo in base alle esigenze specifiche dell'esperimento. La media delle righe si riferisce al numero di volte in cui ogni linea X verrà scansionata per ottenere un risultato medio. Inizia con una media di linea 2X Per l'imaging degli eventi di traffico di membrana e ottimizza secondo necessità.
selezionare la modalità di scansione XYT nella modalità di acquisizione per abilitare l'utilità Time Series. Quindi, seleziona il periodo di attesa tra i punti temporali nell'intervallo di tempo. Definite il numero di fotogrammi da raccogliere selezionando i fotogrammi.
Utilizzare la modalità di scansione Z-stack con la proiezione di massima intensità per raccogliere le informazioni tridimensionali relative all'evento di traffico di membrana all'interno dell'intera cella. Quindi selezionare la modalità di scansione XYZ in modalità di acquisizione e quindi l'utilità Z-stack diventerà accessibile. Selezionare l'opzione Z wide.
Nella modalità di scansione, definisci le immagini superiore e inferiore dello stack Z utilizzando i pulsanti di inizio e fine. Quindi, definire lo spessore del passo Z facendo clic sulla dimensione del passo Z. Per elaborare l'immagine, fare clic sulla scheda del processo principale nel software Confocal.
Nella scheda progetti aperti all'estrema sinistra, selezionare il file Z-stack interessato. Quindi, nella scheda centrale denominata strumenti di processo, selezionare la funzione di proiezione. Scegli il massimo nel pannello a discesa del metodo e fai clic sul pulsante Applica.
Un'immagine di proiezione Z-stack verrà generata nella scheda Apri progetti. Per generare il video dalle immagini della serie temporale, fare clic sulla scheda file nel software Fiji e aprire la funzione per aprire tutte le immagini della serie temporale una per una nell'ordine corretto. In alternativa, trascina le immagini sull'immagine J per aprire i dati nell'ordine corretto.
Quindi trova la funzione stack nella scheda immagine e scegli le immagini da impilare per generare un video. Una volta fatto, salva il file nel formato avi con il frame rate desiderato. Nella vera foglia di piante transgeniche di sette giorni portatrici del promotore ERL1 ERL1 YFP, le cellule sparse sono state evidenziate dal segnale YFP in cui ERL1 YFP ha marcato la membrana plasmatica.
Sono stati osservati anche più segnali puntati, suggerendo che ERL1 era anche localizzato negli endosomi. RFP Ara7 ha evidenziato segnali puntati multipli in quasi tutte le cellule, indicando i corpi multivescicolari, o MVB, in queste cellule. Quando RFP Ara7 si fuse con il segnale ERL1 YFP, la maggior parte dei puntati si sovrappose, suggerendo che alcune molecole ERL1 YFP furono trasportate agli MVB.
Serie temporali di foglie vere recanti ERL1 YFP e proteina marcatrice MVB RFP Ara7 ha mostrato che gli endosomi marcati con YFP si muovevano insieme a RFP Ara7 all'interno delle cellule della linea stomatica. Ha confermato che ERL1 YFP era localizzato nei corpi multivescicolari.
