All'interno di un armadio di biosicurezza, rimuovere il tessuto adiposo murino con una pinza sterile. Una volta rimosso il PBS in eccesso, trasferire il tessuto in un'altra capsula di Petri e lavare due volte per cinque minuti ciascuno con 10 millilitri di soluzione PBS AA. Aggiungere 20 millilitri di soluzione di collagenasi preparata in un becher di cristallo contenente un tessuto frammentato di un centimetro quadrato e una barra magnetica.
Incubare il becher sigillato a 37 gradi Celsius con agitazione continua. Filtrare l'omogenato attraverso un'apertura in acciaio inossidabile da 0,38 millimetri a 40 maglie Filtrare su una capsula di Petri e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Sospendere con attenzione la frazione vascolare stromale in 20 millilitri di DMEM integrato a caldo e centrifugare la sospensione.
Dopo aver scartato il surnatante, lavare delicatamente le cellule due volte con 40 millilitri di terreno DMEM non integrato. Sospendi il palato in cinque millilitri di DMEM integrato. Trasferire la sospensione in una bottiglia T di 25 centimetri quadrati e incubare.
Lavare le celle tre volte con cinque millilitri di PBS AA caldo e due volte con DMEM non integrato. Per rimuovere eventuali detriti cellulari e cellule non murine, aggiungere cinque millilitri di DMEM fresco e caldo integrato e cambiare il mezzo ogni tre o quattro giorni. Una volta che le cellule raggiungono il 90-100% di confluenza, aggiungere un millilitro di soluzione calda di tripsina EDTA alle cellule lavate DMEM.
Incubare per cinque-sette minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere quattro millilitri di DMEM integrato al monostrato cellulare distaccato e disaggregare delicatamente la sospensione. Sospendi le cellule in cinque millilitri di DMEM integrato a caldo.
Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, mescolare delicatamente il pellet in un millilitro di DMEM integrato. Colorare le cellule con il blu tripano e contarle in una camera Neubauer. Cellule seme in boccette T-75.
Per garantire la formazione di colonie e un'elevata proliferazione, osservare la morfologia delle cellule colorate con ematossilina ed eosina al microscopio ottico. La colorazione dell'ematossilina e dell'eosina rivela un citoplasma esteso con prolungamenti allungati e abbondanti microfilamenti intracellulari.
