Inizia mettendo gli embrioni sezionati dal topo femmina gravido di due a sei mesi eutanasia in un mezzo completo freddo con siero bovino fetale all'1%. Dopo aver rimosso il tessuto endometriale, la placenta e il sacco vitellino dall'embrione con ingrandimento 5X, sezionare i progenitori cardiaci dalla regione cardiaca embrionale usando una pinza. Tirare tutte le regioni cardiache sezionate da cinque embrioni di topo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugarli in un secchio oscillante, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e lavare il tessuto con un millilitro di PBS di coltura tissutale. Centrifugare i tubi a 300G per un minuto a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il surnatante e ripetere due lavaggi con un millilitro di PBS.
Una volta fatto, sostituire il PBS con 0,05% Tripsina-EDTA. Centrifugare e ripetere due lavaggi con 0,05% Tripsina-EDTA. Per digerire il tessuto, aggiungere 50 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% e riscaldare per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi, applicare una leggera dissociazione meccanica dopo cinque minuti aspirando la sospensione su e giù utilizzando una punta del filtro a orifizio largo. Inattivare l'attività di digestione della tripsina aggiungendo 350 microlitri di mezzo completo alle cellule dissociate. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare di 40 micrometri.
Preparare le cellule per il congelamento centrifugando la sospensione cellulare appena dissociata. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di congelamento refrigerato. Trasferire la sospensione cellulare in un flaconcino criogenico pre-raffreddato e posizionare il flaconcino criogenico in un contenitore di congelamento pre-raffreddato.
Posizionare il contenitore di congelamento a meno 80 gradi Celsius per quattro-otto ore prima di trasferirlo in azoto liquido per esperimenti di sequenziamento.
