Iniziare posizionando la sospensione di cellule cardiache embrionali dissociate congelate contenenti fiale criogeniche in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per uno o due minuti. Aggiungere un millilitro di mezzo completo, preriscaldato a 37 gradi Celsius alla sospensione scongelata e mescolare tre volte con una pipetta. Quindi trasferire la sospensione su un tubo conico da 15 millilitri, contenente 10 millimetri di mezzo completo caldo.
Passare l'intera sospensione cellulare su un colino da 30 micrometri e sciacquare il filtro con uno o due millilitri di mezzo caldo e completo. Raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo conico. Quindi, centrifugare i tubi a 300 G per cinque minuti.
Dopo aver rimosso il surnatante, lavare il pellet con PBS e trasferire la sospensione cellulare in un micro tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare e aggiungere 100 microlitri delle microsfere magnetiche fornite alle celle pellettate. Omogeneizzare la sospensione cinque volte utilizzando una punta di pipetta di cinghiale larga prima di 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
Nel frattempo, sciacquare la colonna di separazione magnetica con 500 microlitri di tampone legante. Una volta completata l'incubazione, diluire la miscela di sospensione a cellule microsfere utilizzando 500 microlitri di tampone legante. Quindi, aggiungere 0,6 millilitri della sospensione cellulare alla colonna di separazione magnetica.
Raccogliere l'effluente della cellula viva in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi, sciacquare il micro tubo da 1,5 millilitri che conteneva la sospensione cellulare utilizzando un millilitro di tampone legante. Dopo il risciacquo, trasferire il tampone legante dal microtubo da 1,5 millilitri alla colonna e raccogliere l'effluente nello stesso tubo da 15 millilitri.
Ripetere il risciacquo del tubo da 1,5 millilitri utilizzando un millilitro di tampone legante. Dopo aver centrifugato l'effluente a 300 G per cinque minuti, rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Aggiungere un millilitro della soluzione PBS BSA e mescolare delicatamente mediante pipettaggio utilizzando una punta di pipetta a orifizio largo.
Quindi trasferire la sospensione cellulare in un micro tubo da 1,5 millilitri. Ancora una volta, centrifugare la sospensione cellulare e rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Ripetere i due lavaggi da un millilitro di PBS BSA.
Dopo aver rimosso il millilitro di PBS BSA, risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione PBS BSA. Mescolare pipettando 10 volte. Determinare la concentrazione eseguendo un test di tripano blu per garantire un conteggio delle cellule superiore o uguale a 100.000 cellule ed eseguire una valutazione basata sulla fluorescenza per la vitalità delle cellule.
La fase aggiuntiva di selezione e rimozione delle cellule morte dopo lo scongelamento ha permesso l'approvvigionamento di una sospensione cellulare più pulita con una vitalità cellulare significativamente più elevata e ha migliorato la qualità del campione di partenza. Per una maggiore precisione, sono stati utilizzati due diversi metodi di conteggio per quantificare le cellule e i nuclei, tra cui il blu di tripano e la valutazione della vitalità basata sulla fluorescenza. In questo protocollo, è stato osservato che la vitalità cellulare è passata dall'80 al 90% prima dell'isolamento dei nuclei a meno del 5% dopo l'isolamento dei nuclei.
