Inizia posizionando un topo maschio eutanasia di sette-otto settimane su una superficie pulita della panchina. Tagliare la pelle addominale del topo con un paio di forbici verso l'addome inferiore. Asportare il tessuto adiposo dall'interno coscia.
Posizionare il tessuto asportato nel tubo C su ghiaccio contenente 2,5 millilitri di una miscela enzimatica di enzimi D, R, A e 2,35 millilitri di DMEM / F12 senza FBS o antibiotici. Usando le forbici, tagliare il tessuto adiposo in pezzi di circa due millimetri quadrati. Chiudere saldamente il tappo del tubo C e capovolgere il tubo.
Attaccare il tubo al manicotto di un dissociatore tissutale e digerire i campioni a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Successivamente, preriscaldare i mezzi DMEM / F12 contenenti FBS e antibiotici a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere il tubo C dal dissociatore tissutale e interrompere la digestione aggiungendo cinque millilitri di DMEM / F12 con FBS e antibiotici.
Pipettare delicatamente quattro volte. Centrifugare la sospensione a 700 g per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Senza disturbare la tavolozza cellulare, aspirare con cura il surnatante.
Risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12 contenente FBS e antibiotici e pipettare delicatamente cinque volte. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare di 70 micron di diametro posizionato su un tubo da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 250 g per cinque minuti.
Risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS. Prima della placcatura, centrifugare la sospensione cellulare a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante.
Risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM / F12 contenente FBS e antibiotici. Mescolare pipettando delicatamente la sospensione, 10 volte. Piastra 10 millilitri della sospensione su un piatto rivestito di collagene di 10 centimetri.
Posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare. Aspirare il mezzo e lavare le celle tre volte con tre millilitri di PBS per lavaggio. Aggiungere 10 millilitri di DMEM / F12 contenente FBS e antibiotici e incubare.
La colorazione Oil Red O ha mostrato adipociti carichi di lipidi sette giorni dopo aver indotto la differenziazione degli adipociti. Il grado di piena differenziazione è stato confermato dall'analisi dell'espressione dell'mRNA dei regolatori dell'adipogenesi. Rosiglitazone ha indotto un effetto dose-dipendente sui livelli di espressione di geni specifici del grasso bruno come Ucp1 e Ppargc1a.
Tuttavia, per Fabp4, l'effetto saturo a 0,1 micromole concentrazione di rosiglitazone. Gli adipociti differenziati possono essere utilizzati per varie analisi funzionali e meccanicistiche come l'analisi del tasso di consumo di ossigeno e l'immunoprecipitazione della cromatina.
