Prima della colorazione immunofluorescente multiplex, fissare il tessuto ed eseguire la deparaffinizzazione e l'inibizione della perossidasi endogena. Quindi, per la colorazione immunofluorescente multiplex, immergere i vetrini in un barattolo di colorazione da 300 millilitri contenente tampone citrato da 10 millimolari accompagnato da Triton X-100 allo 0,1%. Posizionare il barattolo di colorazione con il coperchio chiuso in un forno a microonde per tre-cinque minuti alla massima potenza fino a quando il tampone inizia a bollire.
Dopo l'ebollizione, lasciare il tampone a temperatura vicina all'ebollizione mettendo il microonde a bassa potenza per 15 minuti. Ancora una volta, riscaldare il buffer mettendo il microonde alla massima potenza per 90 secondi. Rimuovere il barattolo dal microonde e lasciare raffreddare il tampone per 15 minuti a temperatura ambiente.
Risciacquare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno in acqua distillata, seguiti da cinque minuti di risciacquo in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,1% Tween 20 o TBS Tween. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere l'interpolazione TBS asciugando le diapositive su un tovagliolo di carta. Quindi, posizionare i vetrini su una scatola di vetrini per microscopio e circondare il tessuto con una penna idrofobica.
Bloccare i siti di legame non specifici coprendo il tessuto con il 5% di BSA disciolto in TBS Tween. Dopo 30 minuti, rimuovere il buffer di blocco tamponando le diapositive su un tovagliolo di carta. Quindi, incubare il tessuto per 60 minuti con 300 microlitri di anticorpo primario diluito in 1% BSA, TBS Tween.
Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini tre volte per tre minuti ciascuno con TBS Tween. Dopo il lavaggio, incubare il tessuto per 40 minuti con 300 microlitri di anticorpo secondario Poly-HRP. Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini tre volte per tre minuti ciascuno con TBS Tween.
Quindi, incubare il tessuto per 10 minuti con 300 microlitri di reagente tiramide fluorocromo diluito 200 volte in tampone borato estemporaneamente integrato con perossido di idrogeno allo 0,003%. Quindi sciacquare i vetrini tre volte con TBS Tween e incubare il tessuto durante la notte a quattro gradi Celsius con l'anticorpo pan-citocheratina umano diluito in 1% BSA, TBS Tween. Il giorno successivo, sciacquare il tessuto con TBS Tween e incubare per 120 minuti con l'anticorpo secondario direttamente accoppiato con fluorocromo diluito 200 volte in 1% BSA, TBS Tween.
Dopo l'incubazione, sciacquare il tessuto con TBS Tween prima di colorare i nuclei con bisBenzimide diluito 1.000 volte in 10% BSA, TBS Tween per cinque minuti. Risciacquare il tessuto tre volte per tre minuti ciascuno in acqua distillata prima di montarlo su un vetrino utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza e vetro di copertura borosilicato. Per l'analisi delle immagini, importare le scansioni in un software di analisi delle immagini.
Quindi vai alla scheda Analisi e seleziona l'algoritmo di fluorescenza ad alto plex facendo clic su Impostazioni, Azioni e quindi su Carica. Selezionare la scheda Selezione colorante e il colorante di interesse. Nella scheda Rilevamento nucleare, vai a Tipo di segmentazione nucleare e seleziona AI Custom.
Quindi, nel Classificatore di segmentazione nucleare, selezionare il salvato addestrato AI.In scheda Rilevamento membrana e citoplasma, scegliere il raggio massimo del citoplasma e il numero di coloranti di membrana. Per ogni colorante, selezionare la soglia nucleo-positivo, la soglia citoplasma-positiva e la soglia mucosa-positiva. Per ogni colorante, selezionare la percentuale di nucleo, membrana e citoplasma dei valori di completezza.
Salvare l'algoritmo selezionando Impostazioni, Azioni e Salva. Analizzare l'area di interesse facendo clic su Analizza e selezionando Layer annotazione. Quindi vai alla scheda Risultati e seleziona tutti i dati in Dati oggetto.
Esportare i dati in formato CSV facendo clic con il pulsante destro del mouse su Esporta e selezionando objectdata.csv. Viene mostrato un risultato rappresentativo della colorazione ottimale mediante immunofluorescenza multiplex. La scelta della corretta diluizione è stata essenziale per verificare la specificità anticorpale e ottimizzare il rapporto segnale-rumore della colorazione.
