Per iniziare, prendi i frammenti di DNA della cellula scarsamente estratti con biotina. Preparare una miscela master aggiungendo i reagenti per la coda dATP e incubare il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, inattivare Klenow exo-minus incubando il campione per 10 minuti a 65 gradi Celsius e raffreddandolo su ghiaccio.
Dopo aver lavato le perline con 300 microlitri ciascuna di TB, NTB e 100 microlitri di tampone di legatura, risospenderle in 50 microlitri di tampone di legatura. Aggiungere quattro microlitri di miscela adattatrice pre-ricotto da 15 micromolari e un microlitro di 2000 unità per microlitro di DNA ligasi T4 al campione. Lavare le perline con 400 microlitri di TB, 200 microlitri di NTB e 100 microlitri di tampone di restrizione due.
Dopo aver amplificato la libreria mediante PCR, raggruppare tutte le reazioni da 50 microlitri dallo stesso campione in un tubo a basso legame di DNA da 1,5 millilitri. Posizionalo su un tubo magnetico e attendi che tutte le perline siano attaccate al muro. Trasferire il surnatante contenente la libreria in un nuovo tubo a basso legame DNA da 1,5 millilitri e rabboccare con tampone TLE a 500 microlitri.
Per eseguire una selezione fronte-retro utilizzando la purificazione a perline paramagnetiche, aggiungere 200 microlitri di perline di brodo alla libreria, mescolare a vortice e incubare per 10 minuti, ruotando a temperatura ambiente. Quindi, posiziona la libreria su un magnete e attendi che tutte le perline siano attaccate al muro. Trasferire il surnatante contenente la libreria in un nuovo tubo a basso legame di DNA da 1,5 millilitri.
Concentrare le perle prendendo 750 microlitri di perline e mettendole in un tubo da 1,5 millilitri su un magnete. Una volta che tutte le perle sono attaccate al muro, rimuovere il surnatante e risospendere le perline vorticando in 300 microlitri di nuove perle di stock. Aggiungere 300 microlitri di perle concentrate al campione.
Mescolare a vortice e incubare per 10 minuti, ruotando a temperatura ambiente. Posizionare su un magnete. Attendere che tutte le perline siano attaccate al muro e rimuovere il surnatante.
Lavare le perle aggiungendo un millilitro di etanolo al 70% al tubo con le perle ancora sul magnete. Lasciare asciugare le perle all'aria e risospenderle in 21 microlitri di tampone TLE mediante vortexing. Per eluire la libreria dalle perline, incubare il campione per 10 minuti a 37 gradi Celsius in un blocco termico.
Posizionare il tubo in un magnete e trasferire il surnatante contenente la libreria in un nuovo tubo a basso legame di DNA da 1,5 millilitri.
